Диссертация (1144759), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Уабаин в концентрации 1 мкМ вызываетдеполяризацию мембраны; электрогенная активность 2-изоформы определяетсякак разница между значениями МПП до и через 30 мин действия 1 мкМ уабаина.Добавление 500 мкМ уабаина вызывает дополнительную деполяризацию волокон.Электрогенная активность 1-изоформы определяется как разница междувеличинами МПП до и через 30 мин действия 500 мкМ уабаина.2.4. МеханографияВ опытах с механографией к центральному сухожильному концу мышцыпривязывали пластмассовое колечко, с помощью которого препарат в дальнейшемукрепляли к штырю механотрона.
Препарат помещали в камеру из плексигласаобъемом 5 мл и иголками жестко прикрепляли за участки ребер к дну камеры.Прямоераздражениемышцыосуществлялиспомощьюпарыхлорсеребряных электродов, один из которых располагался под мышцей, а другой– над ней. Электроды располагали в безнервной части мышцы. Длительностьраздражающего стимула составляла 1 мс.35За 10 – 15 минут до начала регистрации подбирали полярность и порогстимуляции. При минимальной силе тока определяли максимальный ответмышцы для выбора полярности.
Затем, постепенного увеличивая силу тока,добивались максимальной силы сокращения мышцы. Стимуляцию мышцыпроводили с силой тока, в 1.5 раза превышающей необходимую для развитиямаксимального ответа (супрамаксимальное раздражение).Для непрямого раздражения мышцы через всасывающий электрод проводилистимуляцию нерва импульсами длительностью 0.1 мс величиной 2 – 3 порога.Использовали стимулятор A310 Accupulser (World Precision Instruments, Inc.,USA).Мышечные сокращения регистрировали в изометрическом режиме припомощи механотрона FT03-C (Grass Instrument Co, USA).
Мышцу растягивалиприблизительно на треть первоначальной длины, чтобы получить максимальныйответ на стимуляцию. Электрические сигналы с механотрона подавали наусилитель с полосой пропускания 0 – 5000 Гц. Для визуального контроляпроцессов использовали монитор персонального компьютера.2.5. Конфокальная микроскопияДля определения локализации никотиновых холинорецепторов (нХР) и 2изоформы Na,K-АТФазы использовали соответственно -бунгаротоксин (-БТХ)(tetramethylrhodamine--bungarotoxin,Biotium,USA),являющийсявысокоаффинным антагонистом нХР, снабженный флуоресцентной меткой (Bungarotoxin Rhodamin labeled), красный канал ex = 488 нм, em = 565–615 нм иуабаин, меченый специфической флуоресцентной меткой BODIPY (OuabainBodipy, Invitrogen) зеленый канал ex = 488 нм, em 500–545 нм.Сразу же после экстирпации мышцу промывали физиологическимраствором и далее проводили двойное мечение -БТХ и уабаином, как описаноранее (Heiny et al., 2010; Kravtsova et al., 2016).
Инкубацию проводили в растворе,содержащем -БТХ в концентрации 1 мкМ и уабаин в той же концентрации (136мкМ) течение 20 мин. Далее мышцу отмывали в нормальном физиологическомрастворе 15 минут (3 раза по 5 мин). Окрашенную мышцу помещали напредметное стекло, наносили монтирующую смесь (Fluoromount-G), и накрывалипокровным стеклом.Конфокальная система в этих и других экспериментах с применениемданной методики была настроена на одновременную визуализацию двух каналов.Изображения концевых пластинок в этой серии экспериментов снимали наобъективе 63x с числовой апертурой 1.30. Использованное оборудование:конфокальная система Leica TCS SP5, эмиссионный фильтр (от 400 до 850 нм), сполосойдетекцииФлуоресценцию±15нмотрегистрировалимаксимальногонаиспусканиявнутреннемдетекторекрасителя.сканера,соединяющимся с компьютером.
Для обработки изображений использоваликомпьютерную программу LEICA Geo Office.Распределение липидных рафтов оценивали с помощью субъединицы Вхолерного токсина (CTxB), конъюгированной с флуоресцентной меткой AlexaFluor 488 (Fujinaga et al., 2003; Margheri et al., 2014). Кольцо субъединицы Bхолерного токсина связывается с пентасахаридными цепями ганглиозидов GM1 итемсамымявляетсяспецифическиммаркеромлипидныхрафтов.Дляидентификации постсинаптической области мембраны использовали -БТХ).Свежеизолированный нервно-мышечный препарат инкубировали в течение 15мин в физиологическом растворе с добавлением CTxB (1 мкг/мл) и -БТХ (1мкМ).
Затем мышцу инкубировали в течение 20 мин в физиологическом растворес антителами против CTxB. Антитела против CTxB служат для сшивки CTxB спентасахариднымицепямиганглиозидоввсоответствующихучасткахплазматической мембраны. Затем препарат отмывали в течение 30 мин.ИнтенсивностьфлуоресценцииCTxB/-БТХопределялиприследующихпараметрах: ex = 488/555 нм, em = 505–545/610–650 нм.Для частичного удаления холестерина из плазматической мембраныиспользовали метил-β-циклодекстрин (MβЦД).
Комплекс, содержащий MβЦД и37холестерин (MβЦД/хол 5 мМ) использовали для пополнения мембранногохолестерина (Zidovetzki, Levitan,2007; Kasimov et al., 2015). Мышцыинкубировали в физиологическом растворе, содержащем MβЦД/хол в течение 15мин. Время применения и используемая концентрация являются достаточнымидля достижения насыщения плазмолеммы холестерином (Kasimov et al., 2015).ПослевоздействиякомплексаMβЦД/холмышцыпромывали,изатеминкубировали с CTxB (1 мкг/мл) в течение 15 мин. Затем окрашенные мышцыотмывали в течение 15 – 20 мин физиологическим раствором. Мышца во времядобавления веществ и отмывания, съемки изображений находилась в проточном,проаэрированном физиологическом растворе или физиологическом растворе сдобавлением соответствующего флуоресцирующего вещества.
Интенсивностьфлуоресценции CTxB определяли при ex = 488нм, em = 505–545 нм.Изображения были получены с использованием микроскопа OlympusBX51WI с конфокальной установкой Disk Speed Unit и объективом LumPlanPF100xw.Была использованавидеокамера DP71(Olympus)CCD.Анализизображений проводился с использованием программ Cell ^ P (Olympus) иImagePro (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA).
Был использован шаговыйфокус (ECO-MOT) для съемки нескольких оптических слоев по Z-оси.Для исследования липид-упорядоченной фазы плазматической мембранытакже применяли флуоресцентные стеролы.Использовали 22-NBD-холестерин (22-NBD-сholesterol; 22-(N-(7-Nitrobenz2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol, Molecular Probes). Уданного аналога холестерина флуорофор «пришит» к боковой алкильной цепистерина в положении 22 (Ostašov et al., 2013). С помощью 22-NBD-холестеринаоценивают изменения в текучести мембраны, этот холестерин встраивается влипид-неупорядоченную фазу (Loura et al., 2001).
Интенсивность флуоресценции22-NBD-холестерина возрастает в ответ на фазовые изменения при разрушениилипидных рафтов; его распределение в бислое фосфатидилхолина/холестеринапротивоположно распределению холестерина (Loura et al., 2001; Ostašov et al.,2013). Спектральные свойства 22-NBD-холестерина практически не зависят от38фазового состояния бислоя (Ostašov et al., 2013). Концентрация 22-NBDхолестерина в физиологическом растворе была 0.2 мкМ.
Данный раствор былприготовлен из стокового раствора (10 мг/0.1 мл в этаноле). Мышцуинкубировали 20 мин в растворе с -БТХ (1 мкМ) и 22-NBD-холестерином (0.2мкМ), далее мышцу отмывали 3 раза по 5 минут.Второй используемый флуоресцентный стерол– дигидроэргостерол(dehydroergosterol, ergosta-5,7,9(11),22-tetraen-3β-ol) структурно и функциональнонаиболее близок к холестерину. У дигидроэстерола имеется две дополнительныедвойные связи в «кольцах В и С», которые образуют серию сопряженныхтриеновыхдвойныхсвязей,являющиесявысокофлуоресцентными.Дигидроэргостерол предпочтительно связывается с липидными рафтами и служитв качестве их маркераа (Hao et al., 2002; Gallegos et al., 2004; McIntosh et al., 2008).Раствор дигидроэргостерола (5 мМ) приготавливали, как описано ранее (Haoet al., 2002) и хранили при температуре –80°C.
Конечная концентрациядигидроэргостерола равнялась 60 мкМ. Концентрация этанола в рабочемфизиологическом растворе с дигидроэргостеролом не превышала 0.001%.Установлено, что дигидроэргостерол достигает стабильного распределения через30 – 60 мин, устойчивого в течение 18 ч (Hao et al., 2002). Поэтому вэкспериментах с дигидроэргостеролом инкубацию проводили в течение 40 мин.Окрашенную 22-NBD-холестерином или дигидроэргостеролом мышцупомещали на предметное стекло, наносили монтирующую смесь (Fluoromount-G),и накрывали покровным стеклом.В опытах с дигидроэргостеролом и 22-NBD-холестерином для определениялокализации нХР использовали меченый -БТХ. Конфокальная система быланастроена на одновременную визуализацию флуоресценции родамина – красныйканал: λex/λem = 553/577 нм и флуоресценцию стерола.
В случае 22-NBDхолестерина это был зеленый канал λex/λem = 496/538 нм, в случаедигидроэргостерола это был синий канал: λex/λem = 390/506 нм.Изображения в этой серии экспериментов получены с использованиемконфокальной системы Leica TCS SP5 (параметры смотри выше).39Во всех исследованиях на конфокальном микроскопе: флуоресцентныевещества для двойного мечения добавляли в предварительно проаэрированногокарбогеном (95% O2 + 5% CO2) физиологический раствор непосредственно перединкубацией. Все манипуляции с флуоресцентными веществами производили втемноте.Полученные изображения обрабатывали в программе ImageJ. Анализконцевых пластинок проводили, как описано ранее, по контуру свечения -БТХ(Willadt et al., 2016).
Границы концевых пластинок обводили вручную и такимобразом получали «маску». Внесинаптический район анализировался в области~200 мкм2, расположенной снаружи от зоны концевой пластинки, окрашеннойнаиболее интенсивно.Уровень флуоресценции определяли, как усредненную интенсивностьфлуоресценции в произвольных единицах (у.е., которые соответствуют значениюв пикселях) в постсинаптическом и во внесинаптическом районах мембраны.Плотность распределения нХР оценивали по интенсивности свечения в у.е. наединицу площади.
«Маску» от нХР полученную в красном канале переносили наизображение в другом канале той же концевой пластинки для определенияинтенсивностифлуоресценцииотсоответствующегофлуоресцирующегокрасителя.Эксперименты по окрашиванию липидных рафтов с использованием CTxBпроводили совместно с д.б.н. А.М. Петровым на базе кафедры нормальнойфизиологии Казанского государственного медицинского университета (зав. чл.корр. РАН А.Л. Зефиров).Исследования по определению локализации нХР и 2-изоформы Na,KАТФазы,иэкспериментысиспользованием22-NBD-холестеринаидигидроэргостерола проводили на базе Ресурсного центра СПбГУ «Развитиемолекулярных и клеточных технологий».402.6.
Количественная полимеразная цепная реакция (Real-time PCR)Для определения экспрессии мРНК в замороженных препаратах m. soleus(см. раздел 2.2.) крысы был использован метод Real-time PCR, как описано ранее(Matchkov et al., 2012; Kravtsova et al., 2016). Гомогенизацию осуществляли вустройстве TissueLyser (QIAGEN). С этой целью брали мышцу без сухожилий идобавляли раствор Trisol из расчета 1 мл на 50 – 100 мг ткани.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
