Диссертация (1144759), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Все результаты, представленные на защиту,получены лично диссертантом или при его непосредственном участии. Авторомопределены цель, задачи и направления исследования, осуществлены организацияи проведение экспериментов, обработка и анализ данных и их интерпретация,подготовка к публикации статей.Структура и объем диссертации. Диссертация объемом 236 страницсостоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методовисследования, четырех глав собственных результатов и их обсуждения, общегозаключения, выводов и списка цитируемой литературы из 416 наименований (37отечественных и 379 зарубежных источников). Диссертация иллюстрирована 62рисунками и 3 таблицами.Работа поддержана грантами РФФИ №№ 07-04-01027а; 10-04-00970а, 13-0400973а, 16-04-00562а, а также грантами СПбГУ №№ 1.0.133.2010, 1.37.118.2011,1.38.231.2014.14ГЛАВА 1.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ1.1.1. Na,K- АТФаза: основные сведенияNa,K-АТФаза – это интегральный мембранный белок, принадлежащий ксемейству АТФаз Р-типа (ЕС 3.6.1.3). Na,K-АТФаза, как встроенный вцитоплазматическую мембрану фермент, впервые описана в 1957 г. ЙенсомХристианом Скоу (Skou, 1957). За открытие и выдающийся вклад в изучениеNa,K-АТФазы Скоу был удостоен Нобелевской премии по химии в 1997 году.Na,K-АТФаза функционирует в плазматической мембране практически всехживотных клеток. Основная функция этой ферментной системы заключается вподдержании внутри- и внеклеточного баланса ионов натрия и калия.Поддерживаемые Na,K-АТФазой электрохимические градиенты, в свою очередь,обеспечивают движущую силу других транспортных механизмов, играющихважную роль в регуляции клеточного объема, мембранного потенциала,внутриклеточной концентрации ионов, pH, электрической возбудимости (обзоры:Blanco, Mercer, 1998; Mobasheri et al., 2000; Sejersted, Sjogaard, 2000; Glitsch, 2001;Lichtstein, Rosen, 2001; Lopina, 2001; McDonough et al., 2002; Mijatovic et al., 2007;Clausen, 2008; 2013).
Na,K-АТФаза играет основную роль в регуляции водносолевого обмена, является одним из важных факторов, препятствующих развитиюгипоксии и утомления. Таким образом, Na,K-АТФаза является важнейшимрегулятором клеточных функций, который обеспечивает способность возбудимыхклеток воспринимать, кодировать и передавать сигналы, что необходимо длянормального функционирования нервной системы и организма в целом.Активность Na,K-АТФазы регулируется внутриклеточной концентрацией ионовнатрия, внеклеточным калием, уровнем мембранного потенциала. Кроме того, взависимости от вида ткани и типа клетки, активность и биосинтез Na,K-АТФазымогутконтролироватьсяразличныминейромедиаторамиигормонами(катехоламины, инсулин, тиреоидные и кортикостероидные гормоны и др.),экзогенными и эндогенными дигиталисоподобными факторами, а также зависят15от двигательной активности. Снижение активности Na,K-АТФазы является однимиз наиболее общих признаков различных форм патологий, включая сердечнососудистые заболевания, диабет, возрастную невропатологию, депрессивныерасстройства и др.
(обзоры: Blaustein, 1993; Lichtstein, Rosen, 2001; Schoner, 2002;Mijatovic et al., 2007; Bagrov et al., 2009; Blaustein, 2016).Транспорт ионов натрия и калия Na,K-АТФазой осуществляется за счетАТФ-зависимых циклических переходов из конформационного состояния E1 в Е2и обратно. Считается, что 70% молекул фермента находится в E1 конформации,когда клетка находится в покоящемся состоянии. Е1 и Е2 конформацииразличаются и по сродству к переносимым катионам и чувствительности кспецифическому ингибитору Na,K-АТФазы уабаину. Каталитический циклначинается с селективного связывания трех ионов натрия (E1).
Далее Na,KАТФаза спонтанно переходит в новое конформационное состояние (Е2) ипроисходит связывание двух ионов калия (Post et al., 1972; Takeuchi et al., 2008).Переход фермента из стадии E1 в Е2 активируется ионами магния. При этом натранспортировку трех ионов натрия из клетки и одновременно двух ионов калия вклетку используется одна молекула АТФ.Таким образом, из клетки за один цикл суммарно удаляется одинположительный заряд. Это является важнейшей особенностью функционированияNa,K-АТФазы которая называется электрогенная активность. Поэтому величинамембранного потенциала покоя (МПП) клетки определяется не только ионнымиградиентами.
На мембране формируется дополнительная разность потенциалов засчет этого прямого электрогенного эффекта Na,K-насоса (Sperelakis, 2001),которая в различных кленках различается по величине и функциональной роли. Внекоторых нейронах ЦНС, в скелетных мышечных волокнах этот электрогенныйкомпонент может достигать 10 – 20 мВ (Thomas, 1972; Gorman, Marmor, 1974;Vyskocil et al., 1983; Hicks, McComas, 1989; Nikolsky et al., 1994; Sperelakis, 2001;Krivoi et al., 2003; Dobretsov, Stimers, 2005). В таких клетках уабаин,блокирующий электрогенный компонент Na,K-АТФазы вначале вызывает дозозависимую быструю деполяризацию мембраны, далее МПП снижается вследствие16уменьшения градиента ионов калия. Этот феномен используют как методическийподход для оценки электрогенной активности Na,K-АТФазы (Delbono, Kotsias,1988; Krivoi et al., 2003; Heiny et al., 2010; Chibalin et al., 2012; Kravtsova et al.,2016).Наоборот, активация Na,K-АТФазы, вызывает гиперполяризацию мембраныклеток.
Например, активация Na,K-АТФазы с помощью агонистов нХР в низкойконцентрации в скелетных мышцах млекопитающих вызывает гиперполяризациюсарколеммы около 4 – 5 мВ (Кривой, 2000; Clausen et al., 1993; Nikolsky et al.,1994), а при активации Na,K-АТФазы частотной стимуляцией - до 10 мВ (Hicks,McComas, 1989). Активация Na,K-АТФазы и увеличение электрогенногокомпонента МПП принципиально важны для поддержания сократительнойфункции и работоспособности нервно-мышечного аппарата в условиях действияальтерирующих факторов, например, при утомляющей активности (обзоры:Sejersted, Sjogaard, 2000; Clausen, 2003; 2008). В ЦНС, где наблюдаетсязначительноеповышениевнеклеточнойконцентрацииионовкалияпринейрональной активности, ключевую роль в поддержании калиевого балансатакже играет Na,K-АТФаза и её электрогенная активность (Dobretsov, Stimers,2005; Larsen et al., 2016).Поддержание электрогенеза скелетного мышечного волокна являетсясовершеннонеобходимымфакторомобеспечениянормальногофункционирования нервно-мышечного аппарата.
Снижение активности и/илиуровня экспрессии Na,K-АТФазы наблюдаются и при нарушении двигательнойактивности, в частности при травмах и некоторых мышечных патологиях (Boon etal., 2012; Perry et al., 2015; Wyckelsma, McKenna, 2016). Как следствие развиваетсядеполяризациямембранымышечныхволокон,чтоможетприводитькинактивации натриевых каналов, снижению возбудимости волокон, замедлениювременного течения мышечных потенциалов действия (ПД), нарушениюфункционирования электромеханического сопряжения (Wood, Slater, 2001; Mileset al., 2011).171.1.2. Молекулярное разнообразие Na,K-АТФазыNa,K-АТФаза состоит из двух основных полипептидных цепей: большей (субъединицы) и меньшей (β-субъединицы).
Субъединица отвечает закаталитические и транспортные свойства Na,K-АТФазы, имеет молекулярнуюмассу около 112 кДа и имеет десять трансмембранных доменов (М1 – М10), приэтом оба конца пептидной цепи обращены в цитоплазму. (рис. 1.1).Рис. 1.1. Мембранная топология и молекулярное разнообразие α, β и FXYDсубъединиц Na,K-АТФазы в различных клетках и тканях (по: Mijatovic et al., 2007,с изменениями).Центры связывания переносимых ионов локализованы в петле между вторыми третьим трансмембранными доменами (ТМ2 – ТМ3), а места связываниянуклеотидов и фосфорилирования расположены в большом цитоплазматическомучастке между четвертым и пятым трансмембранными доменами (ТМ4 – ТМ5)(Takeuchi et al., 2008; Sandtner et al., 2011).
Наружные домены аминокислотной18цепи α-субъединицы TM1-TM2, ТМ5-ТМ6 и ТМ7-TM8, а также некоторыеучастки ТM4, ТM6 и ТM10 формируют высокоспецифичный рецептор длясердечных гликозидов, которые являются ингибиторами Na,K-АТФазы (Mijatovicet al., 2007; Takeuchi et al., 2008; Sandtner et al., 2011).Субъединица β представляет собой гликопротеин, имеющий молекулярнуюмассу 40 – 60 кДа. Эта субъединица однократно пересекает мембрану, причем Nконец находится в цитоплазме, а С- конец располагается с наружной стороныклеточной мембраны.
Субъединица β содержит несколько внеклеточных местгликозилирования. Данная субъединица играет роль шаперона и необходима длясозревания, локализации, правильной ориентации α- субъединицы в мембране истабилизации белкового комплекса в плазматической мембране. Возможно также,что субъединица β участвует в модуляции аффинности энзима к ионам натрия икалия, а также в клеточной адгезии (Vagin et al., 2012).Na,K-АТФаза помимо α- и β-субъединиц включает также один из белковсемейства FXYD (фенилаланин-Х-тирозин-аспартат, ATP1G1/PLM/MAT8 family).Это короткий одноцепочечный трансмембранный белок с молекулярной массой 8– 14 кДа (Blanco, Mercer, 1998; Sweadner, Rael, 2000, Crambert, Geering, 2003;Clausenetal.,2017).БольшинствобелковFXYDрассматриваюткакдополнительную субъединицу Na,K-ATФазы, которая, в отличие от βсубъединицы,неявляетсякомпонентом,необходимымдляструктурно-функционального созревания Na,K-ATФазы.
Она стабильно встраивается вмембрану только будучи ассоциированной со зрелым комплексом αβ. Болееподробно о семействе FXYD будет написано ниже.Субъединицы Na,K-АТФазы, так же как и многие другие функциональныебелки (обзоры: Драбкина, Кривой, 2004; Le Novère et al., 2002; Massoulié, 2002;Markov et al., 2015; Clausen et al., 2017), экспрессируются в виде различныхмолекулярных форм. Каждая изоформа субъединиц Na,K-АТФазы кодируетсясобственным геном. В настоящее время у млекопитающих идентифицированычетыре изоформы -субъединицы (1 – 4), три изоформы β-субъединицы (β1 –β3) и семь белков семейства FXYD (Therien et al., 2001; Crambert et al., 2002;19Geering, 2006, Mijatovic et al., 2007; Pirkmajer, Chibalin, 2016; Clausen et al., 2017).Хорошоизвестно,чтоэкспрессияизоформNa,K-АТФазызависитотразнообразных факторов: вида ткани, типа клетки, стадии развития организма,действия определенных гормонов и, возможно, уровня клеточной активности (см.обзоры: Sweadner, 1995; Blanco, Mercer, 1998; Mobasheri et al., 2000; Lopina, 2001,Mijatovic et al., 2007).Изоформы-субъединицы.Изоформы-субъединицынесколькоразличаются количеством аминокислотных остатков (1021 – 1028), имеютвысокую степень гомологии (более 90% для изоформ 1 – 3 и 78% дляизоформы 4) (Blanco, Mercer, 1998).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
