Диссертация (1144759), страница 18

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 18)

Оказалось, что и через 3 суток пребывания вфизиологическом растворе образцы геля с никотином вызывали аналогичнуюдеполяризацию (рис. 4.3), что свидетельствовало о стабильности выделенияникотина из силиконовых имплантатов в данный период.БА-72-72ГНСНГВСН-73-74-74-75-75МПП, мВМПП, мВ-73-76-77-78-76-77-78-79-79-80-80-81-810153045600Время, мин15304560Время, минРис. 4.3.

Влияние одного и того же образца силиконового геля с никотиномна МПП мышечных волокон диафрагмы крысы при первичном тестировании(светлые кружки) и после 3 суток пребывания в физиологическом растворе(темные кружки). Результаты единичных экспериментов. А – опыты с гелем снизким содержанием никотина (ГНСН); Б – опыты с гелем с высокимсодержанием никотина (ГВСН). Горизонтальной полоской отмечено времяприсутствия геля на поверхности диафрагмальной мышцы.ВследующихопытахвеличинуМППмышечныхволоконвовнесинаптическом районе мембраны и параметры сокращений регистрироваличерез 3 суток после подшивания геля к m. soleus крысы. В контрольной группе из8 крыс исходная величина МПП составила –64.1  0.3 мВ (308 волокон) (рис.

4.4).Через 3 суток использования ГНСН не наблюдалось достоверных изменений102МПП по сравнению с контрольной группой, гистограммы распределенияМПП были сходными в обоих случаях (рис. 4.4 А).В группе крыс с подшиванием ГВСН значение МПП было ниже на 2.4  0.3мВ (р < 0.01), чем в контрольной группе (гель без никотина), и составило –61.7 0.3 мВ (290 волокон).

В обеих группах форма распределения МПП былаодинаковой, но у крыс с ГВСН распределение было сдвинуто в сторонудеполяризации по сравнению с контролем (рис. 4.4 Б).100А90110Контроль-64,1 ± 0,3 (n=308)100Контроль-64,1 ± 0,3 (n=308)Б9080ГВСН-61,7 ± 0,3 (n=290)8070ГНСН-64,5 ± 0,4 (n=267)6060nn507050404030302020101000-80-75-70-65-60-55-80-50-75-70-65-60-55-50-45МПП, мВМПП, мВРис. 4.4. Гистограммы распределения МПП мышечных волокон вовнесинаптическом районе мембраны m.

soleus у контрольных крыс (гель безникотина) и у опытных крыс (гель с никотином). А – гель с низкимсодержанием никотина (ГНСН); Б – гель с высоким содержанием никотина(ГВСН). Темные столбцы – контроль; заштрихованные столбцы – никотин.ПослерегистрациимеханографическуюМППустановку,исследуемыегдемышцыисследовалиихпереносилинасократительныехарактеристики.

Регистрировали зависимость силы сокращений от амплитудыприложенного стимула (прямая стимуляция), а также исследовали динамикуутомления. Оказалось, что через 3 суток использования геля с никотиномнаблюдается увеличение возбудимости мышечных волокон m. soleus по103сравнению с контролем (рис. 4.5). Причиной этого явления могла бы бытьнезначительная деполяризация, наблюдаемая через 3 суток использования геля сникотином, которая в свою очередь могла бы приводить к снижению порогавозбудимости мышечных волокон. Однако на данный момент трудно дать ясноеобъяснение механизма этого эффекта.

Данный вопрос требует отдельногоизучения и выходит за рамки настоящей работы.53Амплитуда, г43221100102030405060Амплитуда стимула,ВРис. 4.5. Зависимость силы сокращений m. soleus крысы от амплитудыприложенного стимула (прямая стимуляция) в контрольных мышцах (гель безникотина) и в мышцах после 3 суток действия геля с никотином. 1 – контрольныемышцы; 2 – гель с низким содержанием никотина (ГНСН); 3 – гель с высокимсодержанием никотина (ГВСН).В условиях тетанической стимуляции мышц один раз в секунду пачкамистимулов с частотой 66 имп/с (длительность пачки 0.4 с) не наблюдалосьдостоверныхизмененийвдинамикииспользования геля с никотином (рис.

4.6).утомлениямышцчерез3суток104А120100Сила сокращения, %Сила сокращения, %120Контроль80604020ГНСН00306090Время, сек120150Б100Контроль806040ГВСН2000306090120150Время, секРис. 4.6. Динамика утомления m. soleus крысы через 3 суток послеподшивания геля. Черный цвет – гель без никотина (контроль); серый цвет – гельс никотином. Стимуляция тетанусами один раз в секунду пачками стимулов счастотой 66 имп/с (длительность пачки 0.4 с).

А – опыты с гелем с низкимсодержанием никотина (ГНСН); Б – опыты с гелем с высоким содержаниемникотина (ГВСН). По оси ординат – максимальная сила тетаническихсокращений относительно первого сокращения в процентах.Данное исследование было важно и с той точки зрения, что в условияхлокальной доставки никотина к мышце можно было проверить принципиальнуювозможность хронического влияния никотина на мышцу без побочных системныхэффектов, которые неизбежно сопутствуют другим способам хроническойникотинизации (инъекции, применение специальных помп, доставка с питьевойводой).Ранее было установлено, что в клетках С2С12 аппликация карбахолина (10мкМ) в течение 4 суток вызывала гиперполяризацию мембраны (Henning et al.,1994; Kragenbrink et al., 1996).

В наших опытах никотин в микромолярнойконцентрации при постоянной аппликации в течение 3-х суток к зрелой скелетноймышце вызывал хроническую деполяризацию мембраны мышечных волокон,105повышение их возбудимости, но не вызывал нарушения работоспособности прииспользованных паттернах стимуляции.4.2.2.

Подкожные инъекции никотинаВ данной части работы для хронической никотинизации крысам подкожно 3раза в день инъецировали раствор никотина по 200 мкл в области шеи из расчетадозы 6 мг/кг/день, используя известные протоколы (Wang et al., 1994; Mayhan etal., 2010), применяемые для моделирования формирования никотиновойзависимости у животных. Контрольным крысам вводили физиологическийраствор без никотина. Опыты проводили с 14 по 21 день хронического действияникотина.В этих опытах из каждой крысы выделяли по два изолированных френикодиафрагмальных препарата. Левую полудиафрагму использовали для регистрацииэлектрогенеза мышечных волокон, правую – для одновременной регистрациисократительных характеристик.

Регистрировали величину МПП и параметры ПДмышечныхволоконвовнесинаптическомрайонемембраны,атакжесократительные характеристики мышц.В группе из 7 крыс, получавших никотин, величина МПП (–73.5  0.2 мВ,481 волокно) была статистически значимо (p < 0.01) меньше по сравнению сконтрольными животными (–75.6  0.3 мВ, 7 крыс, 473 волокна). Деполяризациясоставила 2.1  0.4 мВ (p < 0.01). В обоих случаях гистограммы распределенияМПП имели сходную форму, близкую к нормальной, но у никотинизированныхкрыс распределение было сдвинуто в сторону деполяризации (рис.

4.7).Амплитуда ПД, составившая в контроле 83.0  1.6 мВ, статистическизначимо не изменялась, однако после никотинизации замедлялось времяполуспада ПД (с 575 ± 14 мкс до 637 ± 14 мкс, р < 0.05), наблюдалась тенденция кзамедлению времени их нарастания (с 306  8 мкс до 330  10 мкс).106Контроль-75.6 ± 0.3 мВ(473 волокна)150125Никотин-73.5 ± 0.2 мВ(481 волокно)n1007550250-90-80-70-60МПП, мВРис. 4.7. Гистограммы распределения МПП мышечных волокон диафрагмыкрысы у контрольных животных (темные столбцы) и у крыс, получавших никотин(светлые столбцы).Для определения электрогенного вклада в МПП 2-изоформы Na,K-АТФазыприменяли уабаин в концентрации 1 мкМ (селективно блокирует 2-изоформу, невлияя на уабаин-резистентную 1-изоформу) (Krivoi et al., 2003; Hartford et al.,2004).

Электрогенный вклад 2-изоформы определяли, как разницу междузначениями МПП до и через 30 – 60 мин после добавления уабаина.В мышцах контрольных крыс уабаин деполяризовал волокна от –74.1  0.4мВ (270 волокон) до –68.0  0.4 мВ (247 волокна); электрогенный вклад 2изоформы составил –6.1 ± 0.6 мВ (рис. 4.8). В мышцах экспериментальных крысуабаин деполяризовал волокна от –71.9  0.4 мВ (264 волокна) до –68.3  0.4 мВ(272 волокна). То есть электрогенный вклад 2-изоформы составил –3.6 ± 0.6 мВ.Таким образом, у хронически никотинизированных крыс электрогенныйвклад 2-изоформы был статистически значимо (p < 0.01) почти вдвое меньше,чем в мышцах контрольных крыс (рис.

4.8). При этом уровень, до которого107снижается МПП при действии уабаина в контроле и опыте, одинаков (около –68мВ). На основании этих результатов можно предположить, что наблюдаемая вусловиях хронического действия никотина деполяризация волокон обусловленауменьшением электрогенного вклада именно 2-изоформы Na,K-АТФазы.Уабаин-67-68МПП, мВ-69-70-71-72**-73-74-7501530456075Время, минРис.

4.8. Действие уабаина (1 мкМ) на МПП мышечных волокон диафрагмыкрысы у контрольных (темные кружки) и никотинизированных (светлые кружки)крыс. Столбцы справа – электрогенные вклады α2-изоформы Na,K-АТФазы вконтроле (темный) и после никотинизации (светлый). Момент добавленияуабаина отмечен вертикальной стрелкой.Максимальная сила одиночных и тетанических сокращений (прямое инепрямое раздражении мышц), а также площади под кривыми сокращенийникотинизированных крыс статистически значимо не отличались от контрольных(табл.

4.1). Во всех случаях в мышцах никотинизированных крыс отмечаласьтенденция к уменьшению отношения максимальной силы тетаническогосокращения к силе одиночного. При обоих типах стимуляции также наблюдаласьустойчивая тенденция к уменьшению времени нарастания одиночных сокращенийи времени полурасслабления мышц. Сумма этих параметров (время нарастания +время полурасслабления) одиночных сокращений у никотинизированных крысуменьшалась статистически значимо (р < 0.05). Ускорение времени нарастаниятетанических сокращений было достоверным при частоте тетанизации 50 имп/с.108Таблица 4.1. Параметры сокращений диафрагмы у контрольных крыс и укрыс, получавших инъекции никотина.

A1 – нормированная сила одиночногосокращения; A20 и A50 – нормированная максимальная сила соответствующеготетанического сокращения; RT – время нарастания сокращения; T/2 – времяполурасслабления; S1, 20, 50 – площадь под кривой соответствующего сокращения;A20/A1 и A50/A1 – отношение максимальной силы соответствующего тетаническогоОдиночноесокращениеТетанус20 имп/сТетанус50 имп/сОдиночноесокращениеТетанус20 имп/сТетанус50 имп/сПрямая стимуляцияСтимуляция нервасокращения к силе одиночного.

* p < 0.05; ** p < 0.01 по сравнению с контролем.ПараметрыA1, мг/мг весаRT, мсКонтроль932016.20.8Никотин1172014.30.7T/2, мс37.11.832.51.8RT +T/2, мсS1, г x мсA20, мг/мг весаRT, мсS20, г x сA20/A1A50, мг/мг весаRT, мсS50, г x сA50/A153.41.83015320038191198.51.62.20.14841131641126.16.25.20.346.82.3*3335121942158198.72.01.80.15211001316*28.26.34.40.2A1, мг/мг весаRT, мсT/2, мсRT+T/2, мсS1, г x мсA20, мг/мг весаRT, мсS20, г x сA20/A1A50, мг/мг весаRT, мсS50, г x сA50/A11251614.20.734.91.649.11.839849248311841610.81.42.00.165387162535.84.95.20.41361112.80.231.41.344.21.4*3643323725145169.21.41.70.1619551364**32.54.04.60.2109После регистрации указанных выше параметров применяли утомляющуюстимуляцию (непрерывное ритмическое прямое раздражение мышц с частотой 2имп/с в течение 5 мин).

Характеристики

Список файлов диссертации