Автореферат (1144757), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Функционирование Na,K-АТФазы на самых начальных этапахдвигательной разгрузки не исследовано, хотя представляет особый интерес сточки зрения поиска ключевых сигнальных событий, запускающихатрофическую программу. Для изучения этого вопроса нами был примененметод антиортостатического вывешивания задних конечностей крысы, широкоиспользуемый в качестве лабораторной модели гравитационной и двигательнойразгрузки (Morey-Holton et al., 2005). Опыты проводили на камбаловидноймышце крысы в период от 6 ч до 3 суток (72 ч) разгрузки, то есть в период,предшествующий выраженным изменениям атрофического характера.Ужечерез6чвывешиваниянаблюдаласьдеполяризацияпостсинаптического и внесинаптического районов сарколеммы до одинаковогоуровня около –70 мВ и исчезновение локальной гиперполяризации мембраныконцевой пластинки.
Далее, в течение 72 ч вывешивания мембранавнесинаптического района сарколеммы оставалась деполяризованной, инаблюдалось снижение ее возбудимости. Однако в постсинаптическом районе19величина МПП уже через 12 ч вывешивания восстанавливалась доконтрольного значения и оставалась такой на более поздних сроках разгрузки.Локальная гиперполяризация мембраны концевой пластинки такжевосстанавливалась (рис.
5 А, Б).Проведенный анализ показал, что наблюдаемые изменения (и снижение ивосстановление)МППобоихрайоновсарколеммыобусловленысоответствующими изменениями электрогенной активности 2-изоформыNa,K-АТФазы при постоянной активности 1-изоформы (рис. 5 В, Г).Рис. 5. Изоформ-специфическое влияние двигательной разгрузки в течение6 ч – 72 ч на Na,K-АТФазу в камбаловидной мышце крысы. А – Изменениевеличины МПП в постсинаптическом и Б – внесинаптическом районахсарколеммы. В – Изменение электрогенной активности 1- и 2-изоформ Na,KАТФазы в постсинаптическом и Г – внесинаптическом районах сарколеммы. Д– Количество белка и Е – уровень мРНК 1- и 2-изоформ в общем гомогенатемышц. Ж – Локализация 2-изоформы в сарколемме.
Красный канал –распределение никотиновых холинорецепторов, меченых -ВТх; зеленый канал– локализация 2-изоформы (2 NKA), меченой 1 мкМ Bodipy ouabain;20оранжевый цвет – наложение сигналов. Верхний ряд – контрольная мышца;средний и нижний ряды – после 6 ч и 12 ч разгрузки соответственно. Внизу –локализация 2-изоформы во внесинаптической мембране в видеупорядоченных рядов в соответствии с ее распределением в поперечныхтрубочках (Williams et al., 2001; Heiny et al., 2010). Масштаб: 25 мкм.
З –Усредненная флуоресценция от 2-изоформы в постсинаптическом (1) ивнесинаптическом (2) районах сарколеммы. К – контроль; цифры под осью Хобозначают время разгрузки в ч. *p < 0.05 и **p < 0.01 по сравнению ссоответствующим контролем.В период от 12 до 24 ч разгрузки наблюдалось увеличение количествабелка и экспрессии мРНК 2-изоформы в общем гомогенате мышц. Через 72 чразгрузки эти параметры начинали возвращаться к контрольному уровню;количество белка и экспрессия мРНК 1-изоформы Na,K-АТФазы в течениевсего исследованного периода не изменялись (рис. 5 Д, Е).Сравнение результатов, полученных на камбаловидной и диафрагмальноймышцах одних и тех же крыс показало, что во внесинаптическом районефункционирование 2-изоформы напрямую зависит от двигательнойактивности: снижается в неактивной камбаловидной мышце и не изменяется впостоянно сокращающейся диафрагме.
В постсинаптическом районе, помимоэтого, по-видимому, действуют какие-то дополнительные факторы разгрузки,влияющие на электрогенную активность 2-изоформы в обеих мышцахнезависимо от двигательной активности.Роль собственно двигательной активности была проверена нами вследующих опытах. После 6 ч разгрузки изолированную камбаловиднуюмышцу стимулировали в течение 5 мин (нервная стимуляция, 2 имп/с), чтодолжно повышать электрогенную активность Na,K-АТФазы (Hicks, McComas,1989).
Сразу после такой стимуляции наблюдалось восстановление МПП обоихрайонов сарколеммы до уровня, близкого к контрольному; этот эффектотсутствовал при блокировании 2-изоформы Na,K-АТФазы уабаином (100 нМи 1 мкМ), что подтверждают важность двигательной активности дляподдержания функционирования именно 2-изоформы.Причиной снижения электрогенной активности 2-изоформы могло быбыть нарушение ее локализации в сарколемме, например, за счет изменений вмеханизме ее транслокации – обмена между плазматической мембраной ивнутриклеточным пулом Na,K-АТФазы (Benziane, Chibalin, 2008). Однако нашиопыты показали, что количественно 2-изоформа Na,K-АТФазы и ее колокализация с нХР сохраняются через 6 – 12 ч вывешивания; сохраняется21локализация 2-изоформы и во внесинаптической мембране (при небольшомросте через 12 ч разгрузки) (рис.
5 Ж, З).Наши опыты показали также, что подавление активности 2-изоформыпри функциональной разгрузке нельзя объяснить повышенным уровнемэндогенных дигиталисоподобных ингибиторов Na,K-АТФазы или изменениемуровня неквантовой секреции АХ. Даже в состоянии подавленной активностипосле разгрузки 2-изоформа сохраняет способность повышать своюфункциональную активность, что дополнительно подтверждает ее наличие всарколемме.
Эти данные позволяют предположить избирательный механизмподавления функциональной активности 2-изоформы Na,K-АТФазы уже впервые часы функциональной разгрузки камбаловидной мышцы.Аналогичные опыты с вывешиванием были проведены на камбаловидноймышцемонгольскойпесчанки,характеризующейсяповышеннойустойчивостью к условиям аридной зоны обитания и исследуемой в последнеевремя в условиях реального космического полета (Липец и др., 2009).
И в этихопытах нами была обнаружена деполяризация мышечных волокон,обусловленная, как и у крысы, снижением электрогенной активности 2изоформы Na,K-АТФазы. Важное отличие заключается в существеннойзадержке в развитии этих нарушений электрогенеза у песчанки,проявляющихся только через 12 суток вывешивания (Кравцова и др., 2010). Этонаблюдение соответствует данным, по которым развитие атрофическихпроцессов в камбаловидной мышце монгольской песчанки после космическогополета оказались менее глубокими, чем у крыс (Липец и др., 2009).Липидная и структурная перестройка концевой пластинки придвигательной разгрузкеЛипидная перестройка. Как было отмечено выше, опыты с применениемв качестве маркера липидных плотиков субъединицы В холерного токсина,снабженной флуоресцентной меткой (CTхB), показали, что в контрольныхкамбаловидных мышцах крысы оба сигнала от меченого -BTX (красныйканал, нХР) и CTхB (зеленый канал, липидные плотики) локализованы вобласти концевой пластинки и совпадают при наложении.
Такая локализациясохранялась после 6 ч антиортостатического вывешивания (рис. 6 А). Однакодаже такая кратковременная разгрузка вызывала дестабилизацию липидныхплотиков (снижение флуоресценции CTхB) в области концевой пластинки, атакже во внесинаптической мембране, где нарушения были выражены слабее(рис. 6 Б). Нарушение липидных плотиков было подтверждено и прииспользовании для визуализации распределения различных липидных фаз22плазматической мембраны флуоресцентных стеролов – 22-NBD-холестерина идигидроэргостерола (рис. 6 В и Г).Кроме того, нами был проведен анализ изменений липидных плотиков вразгруженной камбаловидной мышце по сравнению с сокращающейсядиафрагмой тех же крыс. В диафрагмальной мышце наблюдались сходныеизменения, что свидетельствует о возможном влиянии на стабильностьлипидных плотиков системных (циркулирующих) факторов, характерных дляданной модели разгрузки.
Однако наблюдаемые нарушения были выраженызначительно сильнее в камбаловидной мышце, что свидетельствует о важнойроли мышечной разгрузки как таковой. Об этом же свидетельствуют и данныед-ра А.М. Петрова, по которым при продлении разгрузки до 12 чвосстановление липидных плотиков не наблюдается. Однако дажекратковременная двигательная нагрузка, вызванная стимуляцией двигательногонерва, приводит к их частичному восстановлению (Petrov et al., 2017).Рис. 6. Влияние двигательной разгрузки на распределение липидныхплотиков в камбаловидной мышце крысы. А – Распределение никотиновыххолинорецепторов, меченых -ВТХ (красный канал), и локализация липидныхплотиков, определяемая по флуоресценции СТхВ (зеленый канал), в концевыхпластинках контрольной мышцы (верхний ряд) и после 6 ч разгрузки (нижнийряд). Оранжевый цвет – наложение сигналов.
Масштаб: 10 мкм. Б, В и Г –23усредненные флуоресценции соответственно СТхВ, 22-NBD-холестерина идигидроэргостерола в контрольных мышцах и после 6 ч разгрузки. Темные исветлые столбцы – соответственно, постсинаптический и внесинаптическийрайоны сарколеммы. *р < 0.05 и **p < 0.01 по сравнению с соответствующимконтролем.Последующие опыты были проведены с целью выявления ролимембранного холестерина в наблюдаемых нарушениях липидной фазымембраны.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
