Автореферат (1144757), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Новизна данной работы заключается в первой попыткекомплексного исследования функционального разнообразия Na,K-АТФазы вскелетной мышце, основанного на особенностях локализации и механизмоврегуляции, а также функциональных взаимодействий с молекулярнымипартнерами изоформ -субъединицы этого белка.Впервые выявлена специфика локализации 2-изоформы Na,K-АТФазы вобласти концевой пластинки, где эта изоформа функциональновзаимодействует с никотиновыми холинорецепторами и мембраннымхолестерином, что лежит в основе физиологического механизма поддержанияпотенциала покоя постсинаптической мембраны. Впервые установленыособенности этих взаимодействий: модулирующим сигналом для 2-изоформыNa,K-АТФазыявляетсяконформационныйпереходникотиновыххолинорецепторов в состояние десенситизации; получены доказательствареципрокного взаимодействия между 2-изоформой и холестерином липидныхплотиков (рафтов).
При исследовании начального периода двигательнойразгрузки скелетной мышцы впервые выявлен ряд структурно-функциональныхперестроек. Установлен адаптационный характер функциональных изменений2-изоформы Na,K-АТФазы; эти изменения проявляются по-разному дляпостсинаптического и внесинаптического пулов 2-изоформы без нарушения6её локализации в сарколемме. Наблюдаемые изменения сопровождаютсядестабилизацией липид-упорядоченной фазы сарколеммы за счет частичнойутраты мембранного холестерина, а также нарушениями распределенияникотиновых холинорецепторов и структуры концевых пластинок.
Полученоподтверждение возможности участия 2-изоформы Na,K-АТФазы в регуляциисократительной функции скелетной мышцы эндогенными кардиотоническимистероидами. Проведенный комплексный анализ свидетельствует офункциональной пластичности 2-изоформы Na,K-АТФазы по сравнению сфункционально стабильной 1-изоформой.Научно-теоретическоеипрактическоезначение.Выяснениефункциональной специализации разных молекулярных форм одного и того жебелка является важной теоретической и практической задачей современнойфизиологии.
Именно на выявлении таких новых механизмов физиологическихфункций основаны современные стратегии поиска эффективных лекарственныхпрепаратов и путей профилактики и коррекции различных патологическихсостояний. Данное исследование направлено на разработку этой проблемы напримерах молекулярного и функционального разнообразия транспортногобелка Na,K-АТФазы. Этот белок является витальным, нарушенияфункционирования которого приводят к тяжелым последствиям вплоть досмертельного исхода.Выявленный в данной работе принцип регуляции за счет функциональноговзаимодействия2-изоформыNa,К-АТФазысникотиновымихолинорецепторами и холестерином применим также для анализаэффективности синаптических связей и молекулярного разнообразия Na,КАТФазы в ЦНС. Этот принцип важен для более глубокого пониманиямеханизмов побочных эффектов применяемых в клинике антихолинэстеразныхпрепаратов, при отравлении такими веществами, а также для изучениямеханизмов никотиновой зависимости и интоксикации.
Полученныерезультаты могут быть использованы при разработке новых методовпрофилактики и коррекции двигательных расстройств при травмах, возрастныхнарушениях, в авиационной и космической медицине (проблемы адаптации кгравитационной разгрузке). Выявленное влияние сверхнизких концентрацийкардиотонических стероидов на сократительную функцию скелетноймускулатуры следует учитывать при использовании этих препаратов в клиникесердечно-сосудистых заболеваний.Результаты могут быть использованы академическими и медицинскимиучреждениями, а также университетами и научно-исследовательскимиинститутами, могут быть востребованы при написании учебников, учебных7пособий и руководств; при подготовке диссертаций и курсов лекций длястудентов бакалавриата и магистратуры.Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены нароссийских и международных конференциях: 12th International ATPaseConference «Na,K-ATPase and Related Transport ATPases of P-type: Structures,Mechanisms, and Roles in Health and Disease» (Denmark, 2008); InternationalSymposium «Biological Motility» (Pushchino, 2008; 2010); 17th IAA Humans inSpace Symposium (Moscow, 2009); PENS Summer Course «Contemporaryproblems of Neurobiology: Molecular mechanisms of synaptic plasticity» (Kazan,2007); 6-я Всероссийская с международным участием Школа-конференция«Системные и клеточные механизмы в физиологии двигательной системы имышечной деятельности» (Москва, 2011); 14th International Conference on Na,KATPase and Related Transport ATPases: Structure, Mechanism, Cell Biology, Healthand Disease (The Netherlands, 2014), 10th и 11th International InterdisciplinaryCongress «Neuroscience for Medicine and Psychology» (Sudak, Crimea, 2014;2015); Съезды Физиологического общества им.
И.П. Павлова (Москва, 2007;Калуга, 2010; Волгоград, 2013; Воронеж, 2017).Публикации. По результатам исследований опубликовано 25 статей визданиях, рекомендованных ВАК РФ, из которых 20 входят в международныебазы научного цитирования Web of Science Core Collection и Scopus; 5 статей вдругих изданиях; 27 публикаций в сборниках тезисов – всего 57 работ.Личный вклад автора. Все результаты, представленные на защиту,получены лично диссертантом или при его непосредственном участии.Автором определены цель, задачи и направления исследования, осуществленыорганизация и проведение экспериментов, обработка и анализ данных и ихинтерпретация, подготовка к публикации статей.Структура и объем диссертации.
Диссертация объемом 236 страницсостоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методовисследования, четырех глав собственных результатов и их обсуждения, общегозаключения, выводов и списка цитируемой литературы из 416 наименований(37 отечественных и 379 зарубежных источников). Диссертацияиллюстрирована 62 рисунками и 3 таблицами.Работа поддержана грантами РФФИ №№ 07-04-01027а; 10-04-00970а, 1304-00973а, 16-04-00562а, а также грантами СПбГУ №№ 1.0.133.2010,1.37.118.2011, 1.38.231.2014.8МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯРабота проведена на изолированных нервно-мышечных препаратахдиафрагмальной и камбаловидной мышц самцов крыс линии Вистар, мышейлиний C57Bl/6 и mdx, а также Монгольской песчанки (Meriones unguiculatus).Условия содержания животных и приемы работы с ними соответствовалинормам российского законодательства, а также рекомендациям Guide for theCare and Use of Laboratory Animals http://www.nap.edu/openbook.php?isbn=0309053773.
В работе использовали проаэрированные (95% O2 + 5% CO2)физиологические растворы, содержащие (в мМ): 137 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl 2, 2MgCl2, 24 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 11 глюкоза, pH 7.4. Растворы приготовляли наоснове бидистиллированной воды из реактивов фирмы Sigma.Электрофизиологические исследования и механография. Мембранныйпотенциал покоя (МПП), потенциалы действия и входное сопротивлениемембраны регистрировали внутриклеточно с помощью стеклянныхмикроэлектродов с внутренними капиллярами (BF150-110-10, Sutter Instrument,Co., USA), изготовленных на микрокузнице Sutter P-97 (Sutter Instrument, Co.,USA) как описано ранее (Krivoi et al., 2006), под контролем бинокулярногомикроскопа PZMTIII (WPI).
Мышечные сокращения регистрировали визометрическом режиме при помощи механотрона FT03 C (Grass Instrument Co,USA) и стимулятора Isostim A320 (WPI). Регистрируемые ответыоцифровывались с частотой квантования 44000/с (электрофизиологическиеисследования) и 5000/с (механография), далее ответы хранились ианализировались на персональном компьютере.Конфокальнаямикроскопия.Дляопределениялокализацииникотиновых холинорецепторов (нХР) и 2-изоформы Na,K-АТФазыиспользовали соответственно -бунгаротоксин (-БТХ) (tetramethylrhodamine-bungarotoxin, Biotium, USA) и уабаин, меченый специфическойфлуоресцентной меткой BODIPY (Ouabain-Bodipy, Invitrogen) (Heiny et al.,2010). Распределение липидных плотиков оценивали с помощью субъединицыВ холерного токсина (CTxB), конъюгированной с флуоресцентной меткойAlexa Fluor 488 (Fujinaga et al., 2003; Margheri et al., 2014). Для исследованиялипид-упорядоченной фазы плазматической мембраны также применялифлуоресцентные стеролы: 22-NBD-холестерин (22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol, Molecular Probes) (Loura et al.,2001; Ostašov et al., 2013) и дигидроэргостерол (ergosta-5,7,9(11),22-tetraen-3βol, Sigma Aldrich) (Hao et al., 2002; Gallegos et al., 2004; McIntosh et al., 2008).Использовали конфокальную систему Leica TCS SP5 или микроскоп Olympus9BX51WI с конфокальной установкой Disk Speed Unit.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
