Автореферат (1144757), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Для селективного блокирования 2-изоформы Na,K-АТФазыприменяли уабаин в концентрации 1 мкМ (Krivoi et al., 2003; Heiny et al., 2010).Как отмечено выше, в контрольных камбаловидных мышцах крысы уже через15 мин действия уабаина наблюдалось снижение уровня флуоресценции СТхВ,что свидетельствует о дестабилизации липидных плотиков (рис. 3 Б). Однакопосле 6 ч разгрузки, когда 2-изоформа практически полностью подавлена,уабаин никак не влиял на стабильность плотиков в постсинаптическом районемембраны (рис.
7 А и Б). Далее присутствие уабаина сохранялось в течениевсего эксперимента. Для встраивания в мембрану экзогенного холестерина мыприменяли добавление в раствор 5 мМ комплекса МЦД/холестерин сповторным окрашиванием СТхВ, после чего наблюдалось полноевосстановление флуоресценции СТхВ (липидных плотиков) до исходногоуровня, несмотря на присутствие уабаина (рис. 7 В и Г).
Аналогичноевосстановление наблюдалось и во внесинаптическом районе сарколеммы.Полученные данные свидетельствуют о возможности путем встраиванияэкзогенного холестерина восстанавливать липидные плотики, разрушенныеингибированием 2-изоформы Na,K-АТФазы и двигательной разгрузкой. Этиданные показывают также, что эффекты уабаина и двигательной разгрузки вотношении липидных плотиков обусловлены снижением уровня именномембранного холестерина.В части опытов мы применяли кратковременное (15 мин) воздействие 1мкМ уабаина с последующим отмыванием нормальным физиологическимраствором.
В отличие от контрольных мышц, где вызванное уабаиномнарушение липидных плотиков было полностью обратимым при отмываниидаже без применения комплекса МЦД/холестерин (рис. 3 В), после 6 чразгрузки восстановления липидных плотиков при отмывании не наблюдалось(рис. 7 Д). Таким образом, эффекты уабаина и двигательной разгрузки неаддитивны и, хотя имеют общий механизм реализации через угнетениеактивности 2-изоформы Na,K-АТФазы, проявляются по-разному.24Рис. 7. Применение комплекса МЦД/холестерин для восстановлениялипидных плотиков в постсинаптическом районе сарколеммыкамбаловидной мышцы крысы после 6 ч разгрузки и блокирования 2изоформы Na,K-АТФазы уабаином (1 мкМ). А – Распределение никотиновыххолинорецепторов, меченых -ВТХ (красный канал), и липидных плотиков,определяемое по флуоресценции СТхВ (зеленый канал), в концевых пластинкахмышцы после 6 ч разгрузки.
Верхний ряд – до добавления в раствор уабаина (0мин); нижний ряд – через 15 мин действия уабаина. Масштаб: 10 мкм. Б –Динамика флуоресценции СТхВ в течение 15 мин действия уабаина; светлые итемные символы – внесинаптический и постсинаптический районы мембраны,соответственно. Момент добавления уабаина отмечен вертикальной стрелкой.Изменения показаны по отношению к начальному уровню флуоресценции,принятому за 1.0. В – Примеры окрашивания липидных плотиков,определяемого по флуоресценции СТхВ (зеленый канал), после 6 ч разгрузки.Масштаб: 10 мкм. Г – усредненная флуоресценция СТхВ. На В и Г показаныизображения и флуоресценция после начального окрашивания СТхВ (СТхВ,светлые столбцы), через 15 мин после добавления уабаина (Oua, светло-серыестолбцы); через 15 мин после добавления 5 мМ комплекса МЦД/холестерин(Oua+МЦД/хол, темно-серые столбцы) и после повторного окрашиванияСТхВ (Oua+CTxB, темные столбцы).
*** р ˂ 0.001 по сравнению ссоответствующим исходным уровнем СТхВ флуоресценции. Д – Усредненная25флуоресценция после начального окрашивания СТхВ (светлые столбцы), через15 мин после добавления уабаина (светло-серые столбцы); через 15 мин послеотмывания нормальным физиологическим раствором (темно-серые столбцы) ипосле повторного окрашивания СТхВ (темные столбцы).Структурнаяперестройка.Ультраструктуранервно-мышечногосоединения и концевой пластинки существенно зависят от двигательнойактивности.Снижениедвигательнойактивностисопровождаетсямногочисленными нарушениями структуры концевой пластинки, включаяизменение ее площади и усиление фрагментации в распределении нХР.Подобные нарушения наблюдаются после денервации и продолжительнойфункциональной разгрузки, при возрастных изменениях, при миодистрофии идругих формах мышечной патологии. Молекулярные механизмы, лежащие воснове такой пластичности нервно-мышечного соединения и концевойпластинки, во многом остаются неясными (Wilson, Deschenes, 2005; Nishimuneet al., 2014; Gonzalez-Freire et al., 2014; Rudolf et al., 2014; Tintignac et al., 2015;Rogers, Nishimune, 2017).
Особый интерес представляет изучение начальныхэтапов двигательной дисфункции, которые могут играть роль триггеров вотношении последующих сигнальных событий. В связи с этим важно, что дажекратковременное снижение двигательной активности m. soleus крысы нарушаетфункционирование 2-изоформы Na,K-АТФазы, а также распределениехолестерина и структура липидных плотиков, которые играют важную роль вкластеризации нХР и стабилизации концевой пластинки (Zhu et al., 2006;Brannigan et al., 2010).В этой части работы была проведена детализация структурных измененийконцевых пластинок камбаловидной мышцы крыс в условиях кратковременнойфункциональной разгрузки (вывешивание).
Оценку распределения нХРпроводили с помощью меченого -ВТХ (красный канал) (рис. 8 А-В). Анализфрагментации в распределении нХР показал, что в контрольных мышцахсреднее количество фрагментов в одной концевой пластинке составило 3.0 ±0.1. Через 6 и 12 ч разгрузки степень фрагментации концевых пластинок неизменялась, что подтверждается постоянством соответствующих кумулятивныхкривых (рис. 8 Г). Однако наблюдался сдвиг кумулятивных кривыхраспределения площадей отдельных фрагментов в область меньших значений(рис.
8 Д). Распределение площадей отдельных фрагментов в контроле,аппроксимированное 3-мя нормальными распределениями, свидетельствовало опреобладании относительно крупных фрагментов со средней площадью 145 ±10 мкм2. Через 6 и 12 ч разгрузки в распределениях площадей уже преобладалиотносительно мелкие фрагменты. Наблюдался также сдвиг пика распределения26площадей крупных фрагментов в область меньших значений (рис.
8 Е-З).Соответственно, общая площадь каждой концевой пластинки, определяемая каксумма площадей всех ее фрагментов, через 6 и 12 ч разгрузки достоверноснижалась (рис. 8 И). Это снижение сопровождалось увеличениемотносительной флуоресценции нХР на единицу площади (рис. 8 К), что можетотражать рост плотности распределения нХР в концевой пластинке иадаптацию к разгрузке. В результате интегральная флуоресценция нХР по всейконцевой пластинке, которая была снижена через 6 ч разгрузки, уже через 12 чразгрузки не отличалась от контроля (рис.
8 Л).Рис. 8. Структурная перестройка концевых пластинок камбаловидноймышцы крысы при двигательной разгрузке. А-В – Примеры изображений27распределения нХР, меченых -БТХ (красный канал), в концевых пластинкахконтрольной крысы (А), и крыс через 6 ч (Б) и 12 ч (В) разгрузки. Масштаб: 10мкм. Г и Д – Кумулятивные кривые, отражающие распределение концевыхпластинок по количеству содержащихся в них фрагментов (Г) и распределениеплощадей отдельных фрагментов (Д): светлые кружки – контроль; красныеквадраты – 6 ч и синие треугольники – 12 ч разгрузки.
Е-З – Гистограммыраспределений площадей отдельных фрагментов концевых пластинок вконтроле (Е), через 6 ч (Ж) и через 12 ч (З) разгрузки. И-Л – Измененияплощади и интенсивности флуоресценции нХР в мышцах контрольных крыс икрыс через 6 ч и 12 ч разгрузки.
И – общая площадь концевых пластинок; К –интенсивность флуоресценции нХР на единицу площади; Л – интенсивностьфлуоресценции, соответствующая общей площади концевых пластинок. **р <0.01 по сравнению с контролем.Кардиотонические стероиды и сократительная функцияВнеклеточные участки -субъединицы Na,K-АТФазы формируютспецифический рецептор для дигиталисоподобных сердечных гликозидов(кардиотонических стероидов, КТС), широко применяемых в клиникесердечно-сосудистых заболеваний. КТС растительного и животногопроисхождения (уабаин, дигоксин, маринобуфагенин и др.) являютсяспецифическими ингибиторами Na,K-АТФазы и имеют сходную стероиднуюструктуру. Из различных тканей и биологических жидкостей животных ичеловека выделены эндогенные аналоги уабаина, маринобуфагенина и другихКТС (Blaustein, 1993; Doris, Bagrov, 1998; Schoner, Scheiner-Bobis, 2007; Bagrovet al., 2009; Lingrel, 2010). Концентрация эндогенных уабаина имаринобуфагенина в плазме крови и цереброспинальной жидкости в норменаходится в наномолярном диапазоне концентраций, но возрастает при рядефизиологических и патофизиологических состояний.Предполагается, что основную роль в усилении сокращения гладкой исердечной мышц при действии уабаина и его эндогенного аналога играет 2изоформа Na,K-АТФазы за счет ее специфической кластеризации с Na+,Са2+обменником, SERCA, рианодиновыми и IP3 рецепторами в местах тесногоприлегания плазматической мембраны к саркоплазматическому ретикулуму(Blaustein et al., 2016).
Положительное инотропное действие КТС показано и вскелетной мышце (Yamamoto et al., 1981; He et al., 2001), однако его механизм иизоформ-специфичность не были исследованы.В наших опытах мы использовали уабаин (Sigma) и маринобуфагенинприродного происхождения (из паротидных желез Bufo marinus, любезнопредоставлен д-ром А.Я. Багровым). Установлено, что уабаин и28маринобуфагенин усиливают одиночные сокращения изолированнойдиафрагмы крысы соответственно с EC50 = 1.2 ± 0.3 нМ и EC 50 = 0.3 0.1 нМ(рис. 9 А), причем эффективный диапазон концентраций соответствует уровнюциркулирующих эндогенных аналогов этих ингибиторов Na,K-АТФазы (cм.Dobretsov, Stimers, 2005).Ранее было показано, что АХ в наномолярном диапазоне концентрацийвызывает не деполяризацию, а гиперполяризацию мышечных волокон за счетувеличения электрогенного вклада 2-изоформы Na,K-АТФазы.
Такимобразом, зависимость величины гиперполяризующего эффекта АХ отконцентрации вещества может служить удобным электрофизиологическимтестом на его способность блокировать 2-изоформу Na,K-АТФазы (Krivoi etal., 2003). Наши опыты показали, что уабаин и маринобуфагенин блокируютвызываемую АХ (100 нМ) гиперполяризацию с IC50 = 4.9 2.7 нМ и IC50 = 2.2 0.7 нМ, соответственно (рис. 9 Б). Эти константы соответствуют диапазонуконцентраций уабаина и маринобуфагенина, усиливающих мышечныесокращения (рис. 9 А), что подтверждает участие 2-изоформы Na,K-АТФазы вреализации этого эффекта.Б25Изменение МПП, мВУсиление сокращений, %А2015105010-1-2-3-4-5-6010-12-1110010-1010-910-8100-710-1010-910-810-710-610Концентрация, МКонцентрация, МРис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
