Автореферат (1144757), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Блокаторы QX222 и проадифен (Tikhonov, Zhorov, 1998; Gentry, Lukas,2001), сдвигающие равновесие в сторону десенситизации (Song, Pedersen, 2000;Ryan et al., 2002), также вызывали гиперполяризацию (30 мин действия),причем их эффекты не были аддитивны с эффектом АХ при совместномприменении, что указывает на общий механизм реализации. Гиперполяризацияпри использовании всех перечисленных лигандов (АХ, никотин, QX222 ипроадифен) блокировалась 50 нМ уабаина (30 мин преинкубации) (рис.
2 В, Г),что свидетельствует о её реализации через активацию 2-изоформы Na,KАТФазы. Напротив, тетракаин, сдвигающий равновесие в сторону состоянияпокоя нХР (Boyd, Cohen, 1984), не влиял на величину МПП, и АХ на его фонебыл способен вызывать гиперполяризацию мембраны (рис. 2 В).Наши данные позволяют предположить, что переход нХР вконформационное состояние десенситизации служит модулирующим сигналомдля 2-изоформы Na,K-АТФазы, причем неважно, чем этот переход вызван –длительным действием наномолярных концентраций агонистов нХР, илидействием неконкурентных блокаторов ионного канала нХР.Функциональное взаимодействие 2-изоформы Na,K-АТФазы ихолестерина. Известно, что мембранные белки взаимодействуют с липиднымокружением, причем холестерин молекулярно связан с нХР и играет важнуюроль в их кластеризации и стабилизации концевой пластинки (Burger et al.,2000; Zhu et al., 2006; Willmann et al., 2006; Brannigan et al., 2010).
Учитывая этиданные, а также роль холестерина в компартментализации, стабилизации ирегуляции Na,K-АТФазы (Chen et al., 2011; Haviv et al., 2013; Cornelius et al.,2015), можно предположить участие холестерина в формированиифункциональной связи между нХР и 2-изоформой Na,K-АТФазы, в том числев качестве молекулярного компонента этого комплекса. С другой стороны,известно, что не только холестерин участвует в регуляции Na,K-АТФазы, но исама Na,K-АТФаза может влиять на формирование кавеол, синтез холестеринаи его траффик.
Это показано для 1-изоформы Na,K-АТФазы (Chen et al., 2009;2011). В отношении 2-изоформы Na,K-АТФазы подобных данных нет.Чтобы понять, может ли сама активность 2-изоформы влиять настабильность липидных плотиков, нами были проведены опыты с применениемуабаина в концентрации 1 мкМ, что селективно блокирует 2-изоформу Na,KАТФазы (Krivoi et al., 2003; Heiny et al., 2010). В качестве маркера липидных15плотиков (рафтов) мы применяли субъединицу В холерного токсина (CTхB),снабженную флуоресцентной меткой (Fujinaga et al., 2003). В камбаловидноймышце крысы оба сигнала от меченого -BTX (красный канал, нХР) и CTхB(зеленый канал, липидные плотики) были локализованы в области концевойпластинки и совпадали при наложении (рис.
3 А). Флуоресценция CTхB впостсинаптическом районе сарколеммы в 4 раза превышала таковую вовнесинаптическом районе, что свидетельствует о концентрации липидупорядоченной фазы мембраны в зоне концевой пластинки.В течение 15 мин действия 1 мкМ уабаина уровень флуоресценции СТхВснижался в постсинаптическом и внесинаптическом районах мембраны на~30% и на ~20%, что указывает на снижение стабильности липидных плотиковпри блокировании 2-изоформы Na,K-АТФазы (рис. 3 Б). Эффект уабаина былполностью обратимым после 15 мин отмывания нормальным физиологическимраствором с последующим повторным окрашиванием СТхВ (рис.
3 В).Поскольку повторное окрашивание маркирует вновь образованные липидныеплотики, увеличение уровня флуоресценции СТхВ свидетельствует овосстановлении их структуры. Для изучения роли холестерина в наблюдаемыхэффектах мы использовали метил--циклодекстрин (МЦД), применяемый длячастичного удаления холестерина из плазматической мембраны (Zidovetzki,Levitan, 2007). Через 15 мин действия 0.1 мМ МЦД наблюдалось аналогичноеснижение уровня флуоресценции СТхВ (стабильности липидных плотиков) впостсинаптическом районе мембраны, как и при ингибировании 2-изоформыNa,K-АТФазы.
Этот эффект сохранялся и после 15 мин отмывания нормальнымфизиологическим раствором с повторным окрашиванием СТхВ, чтосвидетельствует о более устойчивом характере вызванного МЦД разрушениялипидных плотиков по сравнению с уабаином (рис. 3 Г).Для встраивания в мембрану экзогенного холестерина мы применялидобавление в раствор комплекса МЦД/холестерин (5 мМ) (Zidovetzki, Levitan,2007). Добавление этого комплекса с последующим повторным окрашиваниемСТхВ приводило к восстановлению флуоресценции СТхВ до исходного уровня(рис. 3 Г), то есть к восстановлению структуры липидных плотиков.Таким образом, путем встраивания экзогенного холестерина можновосстановить липидные плотики, разрушенные воздействием 0.1 мМ МЦД.
Всвязи с этим важно отметить, что в опытах на диафрагме крысы МЦД (0.1 мМ)устраняет локальную гиперполяризацию постсинаптической мембраны иселективно снижает электрогенную активность 2-изоформы Na,K-АТФазы повсей сарколемме, причем эффект наиболее выражен в постсинаптическомрайоне мембраны (рис. 3 Д).16Рис. 3. Опыты с ингибированием 2-изоформы Na,K-АТФазы уабаином (1мкМ) и применением МЦД (0.1 мМ) для снижения уровня мембранногохолестерина. А – Распределение никотиновых холинорецепторов, меченых ВТХ (красный канал), и липидных плотиков, определяемое по флуоресценцииСТхВ (зеленый канал), в концевых пластинках камбаловидной мышцы крысы.Верхний ряд – до добавления в раствор уабаина (0 мин); нижний ряд – через 15мин действия уабаина.
Масштаб: 10 мкм. Б – Динамика флуоресценции СТхВ втечение 15 мин действия уабаина (начало действия отмечено стрелкой) поотношению к начальному уровню, принятому за 1.0. В и Г – Усредненныефлуоресценции СТхВ в постсинаптическом районе мембраны через 15 миндействия уабаина (В) или МЦД (Г), через 15 мин отмывания нормальнымфизиологическим раствором и после повторного окрашивания СТхВ. На Гсправа – отмывание физиологическим раствором с добавлением комплексаМЦД/холестерин. Д – Электрогенная активность 1- и 2-изоформ Na,KАТФазы в постсинаптическом (1) и внесинаптическом (2) районах мембраныдиафрагмы крысы при действии МЦД.
*p < 0.05 и **p < 0.01 по сравнению ссоответствующим контролем.В опытах с постоянным присутствием 1 мкМ уабаина само по себедобавление комплекса МЦД/холестерин не влияло на уровень флуоресценцииСТхВ в постсинаптическом районе мембраны. Однако после повторногоокрашивания СТхВ наблюдалось полное восстановление флуоресценции СТхВ17до исходного уровня (рис. 4 А, Б). Аналогичное, хотя и менее выраженное,восстановление наблюдалось и во внесинаптическом районе мембраны.
Этифакты свидетельствуют о возможности путем встраивания экзогенногохолестерина восстанавливать липидные плотики, разрушенные блокированием2-изоформы Na,K-АТФазы даже в присутствии уабаина.Рис. 4. Восстановление липидных плотиков в постсинаптическом районемембраны камбаловидной мышцы крысы при блокировании 2изоформы Na,K-АТФазы уабаином (1 мкМ) с помощью комплексаМЦД/холестерин. А – Примеры окрашивания липидных плотиков,определяемого по флуоресценции СТхВ (зеленый канал). Масштаб: 10 мкм.
Б –усредненная флуоресценция СТхВ. На А и Б показаны изображения ифлуоресценция после начального окрашивания СТхВ (СТхВ), через 15 миндействия уабаина (Oua); через 15 мин после добавления 5 мМ комплексаМЦД/холестерин (Oua+МЦД/хол) и после повторного окрашивания СТхВ(Oua+CTxB). *р ˂ 0.05 по сравнению с исходным уровнем СТхВфлуоресценции.Хронические эффекты никотина в скелетной мышцеДанные о функциональной связи между нХР и 2-изоформой Na,KАТФазой, реализуемой через десенситизированное состояние нХР,предполагают возможность долговременной модуляции Na,K-АТФазы вскелетной мышце циркулирующими в наномолярном диапазоне концентрацийхолинергическими лигандами.
Таким лигандом может являться никотин,концентрация которого в крови у курильщиков табака составляет порядка сотеннаномолей, сходные концентрации используются и в опытах с исследованиемхронического действия никотина (Lester, Dani, 1995; Benowitz et al., 1997; Dani,De Biasi, 2001; Dani, 2015).
В условиях хронически действующей низкойконцентрации никотина переход части нХР в состояние десенситизации (Wang,18Sun, 2005; Dani, 2015) может действовать как модулирующий сигнал для Na,KАТФазы.В наших опытах хроническое введение никотина крысам путемподкожных инъекций в течение 2 – 3 недель вызывало снижение электрогеннойактивности 2-изоформы Na,K-АТФазы и деполяризацию мембраны волокондиафрагмальноймышцы.Сходнаядеполяризациянаблюдаласьвкамбаловидной мышце крысы при кратковременном (3 суток) локальномподведении к мышце никотина с помощью силиконовых имплантатов.Введение крысам никотина с питьевой водой в течение 21 – 31 суток такжевызывало деполяризацию мембраны и изоформ-специфические измененияэлектрогенной активности Na,K-АТФазы в диафрагмальной мышце, причемнаибольшую изменчивость демонстрировала 2-изоформа.Изоформ-специфическое влияние двигательной разгрузкина Na,K-АТФазуХорошо известно, что самые разнообразные формы усиления двигательнойактивности характеризуются ростом общего количества Na,K-АТФазы всарколемме скелетных мышечных волокон; длительное снижение двигательнойактивности вызывает противоположный эффект (Clausen, 2008; 2013).Изоформ-специфичность этих изменений, в особенности в условияхдвигательной дисфункции, остается мало изученной и в основном касаетсянарушений хронического характера при травмах (Boon et al., 2012; Perry et al.,2015) и возрастных изменениях (McKenna et al., 2012; Wyckelsma, McKenna,2016).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
