Автореферат (1144757), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Обработку изображенийпроводили с помощью программы ImageJ.Методом ПЦР в режиме реального времени с использованием Taq-Manprobe (FAM) определяли количество мРНК, кодирующей 1- и 2-изоформыNa,K-АТФазы. РНК выделяли с использованием Mini kit (QIAGEN). Реакциюпроводили с использованием обратной транскриптазы III (Invitrogen),SUPERase (Ambion) и специфических праймеров для 1- и 2-изоформ(Applied Biosystems) на аппарате MX3000P (Agilent Technologies).Вестерн-блот анализ использовали для определения количества белка 1и 2-изоформ Na,K-AТФазы в общем гомогенате мышц (Matchkov et al., 2012).Для распределения белков с помощью электрофореза использовали 10% Трисглициновый гель (Bio-rad, USA). Далее белки переносились нанитроцеллюлозную мембрану (GE Healthcare, Life Sciences, USA).Использовали поликлональные антитела: козьи против 1-изоформы Na,KАТФазы (Santa Cruz Biotechnology Inc., USA), кроличьи против 2-изоформы(EMD Millipore) в разведении 1:2000.
В качестве контроля использовали панактин (Cell Signaling Technology) в разведении 1:1000. Связанные антителапроявлялись с помощью усовершенствованного набора хемилюминесценции(ECL; GE Healthcare). Количественный анализ проводили c использованиемпрограммы ImageJ (National Institutes of Health). Разница в экспрессии белковмежду пробами нормализовалась по отношению к экспрессии пан-актина.Методомпламеннойфотометрииизмеряливнутриклеточнуюконцентрацию ионов натрия и калия (FLM3, Radiometer, Copenhagen, Denmark).Двигательная (функциональная) разгрузка задних конечностей.Применяли метод антиортостатического вывешивания задних конечностей поНовикову–Ильину в модификации, широко используемой в качествелабораторной модели гравитационной и двигательной разгрузки (Morey-Holtonet al., 2005).
В этой модели фиксирование производится за хвост, которыйкрепится к ползунку на растяжке вверху клетки, животное можетбеспрепятственно передвигается только на передних конечностях, имеясвободный доступ к корму и воде. При этом сразу и полностью снимаетсявесовая нагрузка на задние конечности и наблюдается отсутствиеэлектромиограммы в камбаловидной мышце крысы в течение первых сутокразгрузки с постепенным восстановлением в последующий период (Kawano etal., 2004; De-Doncker et al., 2005).Хроническое действие никотина.
При исследовании хроническогодействия никотина использовали три различных метода с применениемпротоколов, описанных ранее: метод локальной доставки никотина к скелетной10мышце в течение 3-х суток с помощью нетоксичных силиконовых имплантатов(Connold et al., 1997); подкожные инъекции раствора никотина (Wang et al.,1994; Mayhan et al., 2010) в течение 14 – 21 суток; метод потребления никотинас питьевой водой (Larsson et al., 1988; Sparks, Pauly, 1999; Brunzell et al., 2003) втечение 21 – 31 суток.Статистическую обработку данных проводили с помощью программORIGIN 6.1., Microsoft Excel, GraphPad Prizm5. В тексте и на рисункахприведены средние значения ± стандартная ошибка среднего.
Достоверностьразличия оценивали с помощью t-критерия Стьюдента при условиинормального распределения в выборках, либо однофакторного дисперсионногоанализа ANOVA (программное обеспечение ORIGIN 6.1). КритерийКолмогорова-Смирнова использовали для оценки нормальности распределенияи достоверности различия кумулятивных кривых.Основные эксперименты проведены на базе кафедры общей физиологии иРесурсного центра «Развитие молекулярных и клеточных технологий» СанктПетербургского государственного университета.
Частично экспериментыпроведены совместно с д.б.н. А.М. Петровым на базе кафедры нормальнойфизиологии Казанского государственного медицинского университета (зав. чл.корр. РАН А.Л. Зефиров), а также совместно с д-рами В.В. Мачковым и Е.В.Бузиновой на базе Department of Biomedicine, Aarhus University, Aarhus,Denmark.РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙЛокализация и функционирование 2-изоформы Na,K-АТФазы вконцевой пластинкеДанная часть работы базируется на следующих предпосылках.
Во-первых,установлено, что концентрация ацетилхолина (АХ), освобождающегося внеквантовом виде, достигает в синаптической щели десятков наномолей, засчет чего возникает дополнительная локальная гиперполяризация (surpluspolarization) мембраны в области концевой пластинки (Vyskocil et al., 1983;Nikolsky et al., 1994).
Предполагается, что этот эффект неквантового АХ имеетважное физиологическое значение при формировании синаптического контактаи способствует поддержанию постсинаптического электрогенеза скелетныхмышечных волокон (Маломуж, Никольский, 2010; Vyskocil et al., 2009). Какустановлено работами акад. Е.Е. Никольского и соавторов, локальнаягиперполяризация возникает за счет активации электрогенного Na,K-насоса(Vyskocil et al., 1983; Nikolsky et al., 1994), однако механизм этого эффекта и его11изоформ-специфичность не были изучены.
Во-вторых, исследования намембранных препаратах из электрического органа Torpedo и данные коиммунопреципитации позволяют предположить существование не толькопрямой молекулярной, но и функциональной связи между нХР и Na,KАТФазой (Krivoi et al., 2006; Heiny et al., 2010; Chibalin et al., 2012).Локализация 2-изоформы Na,K-АТФазы. В наших опытах приисследовании локализации 2-изоформы Na,K-АТФазы в диафрагмальноймышце мыши C57Bl/6 и в камбаловидной мышце крысы установлено, чтосигналы от меченого -BTX (красный канал, нХР) и Ouabain-Bodipy (зеленыйканал, 2-изоформа) сконцентрированы в области концевой пластинки исовпадают при наложении.
В обеих мышцах наблюдается локальнаягиперполяризация постсинаптической мембраны величиной 3 – 4 мВ (рис. 1 А,Б). Аналогичная локализация нХР и 2-изоформы отмечена нами и вдиафрагмальной мышце мыши mdx (не показано).Рис. 1. Особенности локализации и функционирования 2-изоформы Na,KАТФазы в концевой пластинке. А и Б – Распределение никотиновыххолинорецепторов, меченых -ВТХ (красный канал), и 2-изоформы, меченойOuabain-Bodipy (зеленый канал), в концевых пластинках диафрагмальноймышцы мыши C57Bl/6 (А) и камбаловидной мышцы крысы (Б). Масштаб: 10мкМ. Графики справа – соответствующие величины МПП и электрогенной12активности 1- и 2-изоформ Na,K-АТФазы в разных районах мембраны.
В и Г– Влияние 50 нМ уабаина на МПП и электрогенную активность 1- и 2изоформ в диафрагмальной мышце крысы. Синие столбцы – величинаэлектрогенной активности (мВ), блокируемая 50 нМ уабаина. 1 и 2 –соответственно, постсинаптический и внесинаптический районы мембраны. **p< 0.01 – различие между указанными районами мембраны.Для оценки электрогенной активности 1- и 2-изоформ Na,K-АТФазы мыиспользовали электрофизиологический анализ констант их блокированияуабаином.
Как ранее установлено, в скелетной мышце уабаин в концентрации 1мкМ селективно подавляет уабаин-чувствительную 2-изоформу, дляподавления уабаин-резистентной 1-изоформы требуется 500 мкМ уабаина(Krivoi et al., 2003). Проведенный нами анализ показал, что локальнаягиперполяризация постсинаптической мембраны является следствиемповышенной электрогенной активности именно 2-изоформы, активность 1изоформы в разных районах мембраны не различается (рис. 1 А, Б).Важно отметить, что эта локальная гиперполяризация полностьюблокируется 50 нМ уабаина без изменений мембранного потенциала покоя(МПП) во внесинаптическом районе сарколеммы (рис.
1 В). При этом впостсинаптическом районе электрогенная активность 2-изоформы снижаетсяпочти вдвое, но не изменяется во внесинаптическом районе мембраны (рис. 1Г). Эти факты можно объяснить тем, что ранее было предсказано наличие двухпулов 2-изоформы Na,K-АТФазы, блокируемых уабаином с константами 150нМ и 9 нМ, причем только пул с более высоким сродством к уабаину (2* нарис. 1 Г) функционально взаимодействует с нХР (Krivoi et al., 2006). Мыполагаем, что именно этот пул 2-изоформы активируется неквантовым АХ иотвечает за локальную гиперполяризацию постсинаптической мембраны иименно он блокируется уабаином в концентрации 50 нМ.Функциональная связь никотиновых холинорецепторов и 2-изоформыNa,K-АТФазы.
Каким может быть механизм этой связи? Ранее было показано,что устойчивая следовая гиперполяризация ганглионарных нейронов крысыпосле действия микромолярных концентраций АХ в основном осуществляетсяза счёт входящих через каналы нХР ионов натрия, активирующих Na,KАТФазу (Park et al., 2010). В наших опытах инкубация с никотином (100 нМ)действительно вызывала увеличение внутриклеточной концентрации Na+ на 22%.
(p < 0.05) (рис. 2 А). Однако после замены наружного Na+ на N-methyl-dglucamine chloride (NMG-Cl), что исключает вход Na+ через открытые каналынХР (Henning et al., 1994), локальная гиперполяризация мембраны сохранялась(рис. 2 Б). Таким образом, входящий Na+ не является решающим фактором13функциональной связи между нХР и Na,K-АТФазой.Наша модель основана на предположении о том, что функциональноевзаимодействие между нХР и Na,K-АТФазой в скелетной мышце обусловленопрямым молекулярным взаимодействием этих белков (Krivoi et al., 2006; Heinyet al., 2010; Chibalin et al., 2012). При этом важно, что АХ способен связыватьсяс нХР в непроводящем десенситизированном состоянии, при которомаффинность рецептора к АХ повышена на 2 – 4 порядка и лежит внаномолярном диапазоне (Prince, Sine, 1999; Wilson, Karlin, 2001; Mourot et al.,2006), сопоставимом с уровнем негидролизованного АХ в синаптической щели.Рис.
2. Исследование механизма функциональной связи между нХР и Na,KАТФазой. А – Изменение внутриклеточной концентрации Na+ в m. soleusкрысы при инкубации с никотином (100 нМ). Б – Величины МПП впостсинаптическом (1) и внесинаптическом (2) районах мембраны вконтрольных диафрагмальных мышцах крысы, и в опытах с заменой наружногоNa+ на NMG-Cl. В – Изменение МПП при действии АХ или никотина (100 нМ),QX222 или тетракаина (50 мкМ), в том числе при их совместном применении ина фоне 50 нМ уабаина.
Г – Изменение МПП при действии разныхконцентраций проадифена, а также при его совместном действии с АХ и нафоне 50 нМ уабаина. В и Г – изменение МПП в негативную сторонусоответствует гиперполяризации мембраны. *p < 0.05 и **p < 0.01 посравнению с исходным уровнем МПП перед применением перечисленныхлигандов.14Нами было установлено, что АХ или никотин в концентрациях 100 нМ (15– 30 мин действия) вызывают гиперполяризацию мембраны величиной ~4 мВ(рис. 2 В). Далее мы применили блокаторы канала нХР, сдвигающиеравновесие между конформационными состояниями покоя и десенситизациинХР.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
