Диссертация (1144749), страница 23
Текст из файла (страница 23)
А., 2009], многиевопросы, касающиеся нейрохимических механизмов нарушения центральной регуляциирепродуктивной функции женского организма при ГГЦ, остаются невыясненными. В связис этим представляется целесообразным дальнейшее экспериментальное изучение влиянияэндогенного ксенобиотика ГЦ на среднесуточное содержание и суточные ритмы биогенныхаминов в гипоталамических структурах, ответственных за синтез и секрецию ГнРГ. Эти90исследования могли бы способствовать пониманию общих механизмов повреждающеговоздействия ГЦ на репродуктивную функцию женского организма и могли бы оказатьсяполезными в поиске нейропротекторных соединений, способных предотвратить или ослабитьэто воздействие.***Изложенные в обзоре литературе сведения можно подытожить следующим образом.Установлено, что циркадианная система играет важную роль в формировании репродуктивныхцикловженскогоорганизма.Висследованияхнасамкахкрысбылопоказано,что нейрональный сигнал, исходящий из СХЯ гипоталамуса, ежедневно поступает к МПОгипоталамуса, где находятся тела нейронов, продуцирующих ГнРГ, а также к СВ гипоталамуса– основному нейрогемальному органу, ответственному за секрецию этого нейропептида.Предполагается, что поступающий от СХЯ гипоталамуса циркадианный сигнал обусловливаетвэтихотделахгипоталамусасуточныеизмененияактивностимоноаминергическихи опиоидных систем, которые играют ключевую роль в регуляции синтеза и секреции ГнРГ.Отмечено, что нейротоксические соединения вызывают у самок крыс нарушениясуточных ритмов содержания биогенных аминов в отделах гипоталамуса, ответственныхза регуляцию репродуктивных циклов.
Поэтому первостепенной задачей настоящегоисследования явилось изучение хронического либо острого воздействия неблагоприятныхэкологических факторов, имеющих химическую природу, – обладающих нейротоксическимисвойствами экзогенных (толуол, ДМГ) и эндогенных (ГЦ) соединений на суточные ритмыи среднесуточное содержания НА и ДА в МПО и СВ-Арк гипоталамуса самок крыс.Вместе с тем взаимосвязь между содержанием биогенных аминов и уровнем генерацииАФК (источником которых эти соединения являются) в отделах гипоталамуса, ответственныхза регуляцию репродуктивной функции, по-прежнему остается малоизученной. Наличие такойвзаимосвязипозволилобыиспользоватьпоказательгенерацииАФКвкачестведополнительного маркера активности моноаминергических систем гипоталамуса. Кроме того,изучение уровня образования АФК в гипоталамических структурах могло бы служитькритерием для оценки возможного нейропротекторного эффекта различных антиоксидантов,в частности мелатонина или пептидных биорегуляторов.
Поэтому еще одной задачей данногоисследования стало выявление возможной взаимосвязи между уровнем генерации АФКи содержанием биогенных аминов в гипоталамусе в норме, а также после воздействиянейротоксических соединений и мелатонина.По-прежнему остаются малоизученными вопросы, связанные с участием пинеальнойжелезы в регуляции репродуктивных циклов и, как следствие, с нарушениями этой регуляции,91которые могут быть вызваны снижением синтеза продуцируемого железой мелатонинакак в процессе старения организма, так и в изменяющихся световых условиях. В настоящеевремя мелатонину отводится роль водителя циркадианных ритмов организма млекопитающих.Поэтому следующей задачей данной работы стало изучение роли биогенных аминовв изменении процессов гипоталамической регуляции репродуктивной функции с возрастом,а также в модели преждевременного старения репродуктивной системы, вызываемого не толькоупомянутым выше химическим воздействием (экзогенные и эндогенные ксенобиотики),но и воздействием, имеющим исключительно физическую природу (избыточный световой фон),а также изучение возможности коррекции выявленных нарушений с помощью мелатонинаи пептидных биорегуляторов.Собранныезапоследниетридесятилетияэкспериментальныеданныесоздалипредпосылки для терапевтического применения мелатонина при лечении расстройств,связанных с десинхронизацией суточных ритмов организма человека.
Полученные намирезультатыпозволиливыдвинутьгипотезуотом,чтомелатонин,обладающийсинхронизирующими и антиоксидантными свойствами, а также использованные в данномисследовании пептидные биорегуляторы (пинеалон, эпиталамин, эпиталон) могут служитьпротекторамивызванныхнеблагоприятнымэкологическимвоздействиемнарушенийцентральных механизмов регуляции репродуктивной функции, в частности суточных ритмовактивности моноаминергических систем гипоталамуса.92ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1. ЖивотныеЭкспериментальная работа была проведена на 1080 половозрелых самках крыс линииWistar с массой тела 180-220 г и четырехдневным эстральным циклом (питомник «Рапполово»РАМН, Санкт-Петербург, Россия). Использование белых крыс связано с тем, что этот видпозвоночных широко используется в общебиологических и медицинских исследованиях[Ноздрачев А.
Д., Поляков Е. Л., 2001; Каркищенко Н. Н., 2004].Лабораторныеживотныесодержалисьвстандартныхпомещенияхвиварияс искусственной вентиляцией, оборудованного в соответствии с санитарными требованиями№1045-73 от 06.04.73 [Белоусов Ю. Б., 2005], в клетках размером 62х44х25 см по 5 животныхв каждой клетке при температуре окружающего воздуха в зависимости от времени года 22±2 0С[Душкин В. А., Кривов Л.
И., 1971]. Крысы получали стандартный готовый лабораторный кормс содержанием протеина более 25%, жиров 6-12%, кальция и фосфора 1,0-1,4%, лизинаи метионина 0,7-1,5%, микроэлементов и витаминов 3-4% (ЗАО «Волосовский комбикормовыйзавод», г. Волосово, Ленинградская обл., Россия) и имели неограниченный доступ к пищеи отстоянной водопроводной воде в соответствии с правилами, принятыми Европейскойконвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иныхнаучных целей (г. Страсбург, 1986 г.).
Все опыты на лабораторных животных выполнялисьвсоответствиисположениямиХельсинкскойдекларацииВсемирнойМедицинскойАссоциации о гуманном отношении к животным (ред. 2000 г.), принципами гуманности,изложенными в директиве Европейского Сообщества №86/609 ЕС, «Биоэтическими правиламипроведения исследований на человеке и животных» и «Руководством по экспериментальному(доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005 г.).2.2. Реактивы и препаратыВ работе были использованы следующие реактивы и препараты.Для ингаляции летучих органических веществ:толуол («ч», ОАО «Реактив», Россия).Для введения животным:1,2-диметилгидразина гидрохлорид (Sigma, США); мелатонин (Sigma, США); L-метионин(«хч», ЗАО «Вектон», Россия); пинеалон (Санкт-Петербургский институт биорегуляции93и геронтологии СЗО РАМН, Россия); физиологический раствор (0,9% раствор натрия хлорида;ОАО «Биохимик», Россия); эпиталамин (Санкт-Петербургский институт биорегуляциии геронтологии СЗО РАМН, Россия); эпиталон (Санкт-Петербургский институт биорегуляциии геронтологии СЗО РАМН, Россия); этанол («хч», ОАО «Реактив», Россия).Для выделения структур мозга:азот жидкий.Для определения содержания гонадолиберина в структурах мозга:натрия гидроксид («хч», ЗАО «Вектон», Россия); тест-система для стандартизованногоиммуноферментного определения содержания гонадолиберина в биологических образцах(Peninsula Laboratories, LLC, США); уксусная кислота («хч», ОАО «Реактив», Россия).Для определения уровня половых стероидов в сыворотке крови:антисыворотки к эстрадиолу и прогестерону (Институт физиологии им.
И. П. ПавловаРАН, Санкт-Петербург, Россия); декстран (Serva, ФРГ); дифенилоксазол («хч», ОАО «Реактив»,Россия); 1,4-ди-(5-фенил-2-оксазолилбензол) («хч», ОАО «Реактив», Россия); меченныетритием препараты эстрадиола и прогестерона (Государственный институт прикладной химии,Санкт-Петербург,Россия);натрияацетат(«хч»,ОАО«Реактив»,Россия);толуол(«ч», ОАО «Реактив», Россия); уголь активированный («ч», ОАО «Реактив», Россия); уксуснаякислота («хч», ОАО «Реактив», Россия); фосфатный буфер, рН 7,4 (Sigma, Великобритания);эфир диэтиловый («ч», ОАО «Реактив», Россия).Для определения содержания биогенных аминов и их метаболитов в структурах мозга:ацетонитрил(«чистыйдляхроматографии»,ЗАО«Вектон»,Россия);3,4-диоксибензиламина гидрохлорид (Sigma, США); 3,4-диоксифенилуксусная кислота (Sigma,США); дофамина гидрохлорид (Sigma, США); калия метабисульфит («хч», ЗАО «Вектон»,Россия); лимонная кислота (Sigma, США); натрия октилсульфонат (Sigma, США); натрияцитрат,трехзамещенный,пятиводный(«чда»,ЗАО«Вектон»,Россия);натрияэтилендиаминтетраацетат, двузамещенный («хч», ЗАО «Вектон», Россия); норадреналинагидротартрат (Sigma, США); 5-оксииндолилуксусная кислота (Sigma, США); серотонинакреатинсульфат гидрат (Serva, ФРГ); хлорная кислота («хч», ЗАО «Вектон», Россия).Для определения уровня общего L-гомоцистеина в плазме крови:тест-система для стандартизованного иммуноферментного определения уровня общегоL-гомоцистеина в плазме крови (Axis-Shield Diagnostics Limited, Великобритания).Для определения уровня генерации активных форм кислорода в структурах мозга:водорода пероксид («хч», ОАО «Реактив», Россия); калия фосфат, однозамещенный («хч»,ЗАО «Вектон», Россия); калия хлорид («хч», ЗАО «Вектон», Россия); люминол (Sigma, США);фосфатный буфер, рН 7,4 (Sigma, Великобритания).94Для определения содержания продуктов перекисного окисления липидов в сывороткекрови:бутанол-1 («ч», ОАО «Вектон», Россия); ортофосфорная кислота («чда», ОАО «Вектон»,Россия), 2-тиобарбитуровая кислота («чда», ОАО «Реактив», Россия).Для определения содержания нитритов в сыворотке крови:натрия нитрит («чда», ОАО «Реактив», Россия), 1-нафтилэтилендиамина гидрохлорид(Sigma, США), соляная кислота («осч», ООО «Сигма Тек», Россия), сульфаниловая кислота(«чда», ОАО «Реактив», Россия), цинка сульфат, семиводный («осч», ОАО «Вектон», Россия).Для определения общей моноаминооксидазной активности в структурах мозга:R-депренил (Sigma, США); калия фосфат, однозамещенный («хч», ЗАО «Вектон»,Россия); кинурамина дигидробромид (Sigma, США); натрия фосфат, двузамещенный («хч»,ЗАО«Вектон»,Россия);натрияэтилендиаминтетраацетат,двузамещенный(«хч»,ЗАО «Вектон», Россия); сахароза («хч», ЗАО «Вектон», Россия).Для определения содержания общего белка в структурах мозга и в реакционной смеси:меди сульфат (II), пятиводный («хч», ЗАО «Вектон», Россия); натрия гидроксид («хч»,ЗАО «Вектон», Россия); натрия карбонат («хч», ЗАО «Вектон», Россия); реактив ФолинаЧокалтеу (Sigma, США); трихлоруксусная кислота («хч», ЗАО «Вектон», Россия).2.3.
Общая схема экспериментаВ различных сериях экспериментов в виварии поддерживались следующие световыережимы: стандартное фиксированное освещение (12 ч – день, 12 ч – ночь), световая депривация(24 ч – ночь) и постоянное освещение (24 ч – день). Для измерения освещенности помещений,в которых содержались животные, использовали люксметр «Ф-107» (Россия).
Помещениявивария освещали люминесцентные лампы (освещенность 750 лк на уровне клеток на 1 м2площади). Окна в помещениях отсутствовали.Решение задач, поставленных в диссертации, осуществлялось в семь последовательныхэтапов:1) исследование суточной динамики и среднесуточного содержания биогенных аминовв структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию ГнРГ (МПО и СВ-Арк)на различных стадиях эстрального цикла и в условиях световой депривации;952) исследование суточной динамики и среднесуточного содержания биогенных аминоввМПОиСВ-Аркгипоталамусаприхроническомиостромвоздействиинейротоксических ксенобиотиков (ДМГ, толуол);3) исследование суточной динамики и среднесуточного содержания биогенных аминовв МПО и СВ-Арк гипоталамуса в условиях экспериментальной ГГЦ (метиониноваянагрузка);4) исследование нейротоксических воздействий (ДМГ, толуол, метиониновая нагрузка)на уровень ГнРГ в МПО и СВ-Арк гипоталамуса и показатели окислительного стрессав сыворотке крови;5) исследование влияния мелатонина и пептидных биорегуляторов (пинеалон, эпиталамин,эпиталон) на суточную динамику и среднесуточное содержание биогенных аминоввМПО иСВ-Арк гипоталамуса принейротоксических воздействиях (ДМГ,метиониновая нагрузка);6) исследование возрастных изменений суточной динамики и среднесуточного содержаниябиогенных аминов в МПО и СВ-Арк гипоталамуса;7) исследование влияния мелатонина и пептидного препарата пинеальной железыэпиталона на динамику эстральных циклов у молодых и старых животныхпри различных световых режимах (стандартное фиксированное освещение, постоянноеосвещение).На отдельных этапах работы дополнительно определяли уровень половых стероидов(эстрадиол, прогестерон) и общего ГЦ в сыворотке и плазме крови, соответственно,а также моноаминооксидазную активность в вышеупомянутых гипоталамических структурах(МПО и СВ-Арк).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
