Диссертация (1144749), страница 26
Текст из файла (страница 26)
эквивалентна 1 мВ). В качестве контроля использовали смесь фосфатного буфераи люминола (15:1, v/v). Уровень хемилюминесценции рассчитывали в относительных единицахна миллиграмм общего белка, который определяли по методу Лоури [Lowry O. H. et al., 1951].2.10. Определение содержания продуктов перекисного окисления липидовв сыворотке крови по тесту с 2-тиобарбитуровой кислотойспектрофотометрическим методомПринцип метода основан на определении интенсивности окраски, образующейся в ходереакции между малоновым диальдегидом и 2-тиобарбитуровой кислотой, протекающейв кислой среде и при высокой температуре.
Образующийся в результате реакции триметиновыйкомплекс,содержащийоднумолекулумалоновогодиальдегидаидвемолекулы2-тиобарбитуровой кислоты, имеет характерный спектр поглощения с максимумом при 535 нм[Арутюнян А. В., Дубинина Е. Е., Зыбина Н. Н., 2000].К 0,2 мл сыворотки крови прибавляли 3 мл 2% раствора ортофосфорной кислоты(рН 1,3) и 1 мл 0,8% раствора 2-тиобарбитуровой кислоты. Пробы выдерживали в течение45 мин.
при +100 0С. Затем смесь охлаждали и экстрагировали окрашенный продукт 3 млбутанола-1. Разделения водной и органической фаз достигали центрифугированием (1 000 g,10 мин.). Затем, чтобы избежать мутности образцов, измеряли оптическую плотностьбутанольных экстрактов при двух длинах волн (535 нм и 580 нм) на спектрофотометре DU-65(Beckman, США). Бутанольный экстракт контрольной пробы готовили аналогично опытнымпробам, используя вместо сыворотки крови 0,2 мл дистиллированной воды.
Для расчетасодержания продуктов перекисного окисления липидов использовали формулу:С=∆Е535-580Кl, где:105∆Е535-580 – разница оптических плотностей бутанольныхэкстрактов при двух длинах волн;К – 1,88105 М-1см-1;l – длина светового пути, см.2.11. Определение содержания нитритов в сыворотке кровиспектрофотометрическим методомНитриты – продукты окисления оксида азота молекулярным кислородом или другимиокислителями.Широкоераспространениеполучилспектрофотометрическийметодопределения нитритов в биологических жидкостях с использованием реактива Грисса. Реакциюна нитритные анионы проводят в безбелковом супернатанте сыворотки или плазмы крови[Madueño F., Guerrero M.
G., 1991].Для осаждения белка к образцам сыворотки крови добавляли 30% раствор цинка сульфата(20:1, v/v). После инкубации в течение 30 мин. при комнатной температуре пробыцентрифугировали (2 000 g, 15 мин.), в случае необходимости отфильтровывали через фильтрШотта. С супернатантом проводили реакцию Грисса, для чего к пробам последовательнодобавляли сначала 1% раствор сульфаниловой кислоты в 2 М соляной кислоты, а затем,через 10 мин., реактив Грисса – 0,02% водный раствор 1-нафтилэтилендиамина гидрохлорида.Через 30 мин. развивалась розовая окраска.
Оптическую плотность окрашенных продуктовизмеряли при 540 нм, используя спектрофотометр DU-65 (Beckman, США). Калибровочныйграфик строили по стандартному раствору натрия нитрита.2.12. Определение моноаминооксидазной активности в структурах мозгаспектрофотометрическим методомВ основу метода, описанного в работе [Weissbach Н. et al., 1960] и являющегосяпрототипом использованного в данной работе способа определения моноаминооксидазнойактивности, положена реакция окислительного дезаминирования кинурамина, катализируемаяМАО.
Упомянутый выше метод основан на измерении убыли концентрации кинурамина,приокислениикоторого,вследствиеспонтаннойвнутримолекулярнойциклизации106промежуточного продукта, формируется 4-гидроксихинолин. В вышеуказанной работетакже обращается внимание на возможность определения активности МАО по приростуконцентрации 4-гидроксихинолина, на основании чего и проводилась оптимизация способаопределения активности фермента. В результате предварительного снятия спектрограммреакционной смеси было установлено, что 4-гидроксихинолин имеет два максимумапоглощения при длинах волн 315 и 327 нм.
В настоящем варианте метода приростконцентрации данного продукта регистрируется при 327 нм [Разыграев А. В., Арутюнян А. В.,2006].Реакционная среда представляла собой раствор кинурамина в 0,05 М фосфатном буфере(рН 7,8). Конечная концентрация кинурамина – 0,19 мМ. Оптическая плотность растворакинурамина данной концентрации при 327 нм составляет 0,45.
В методе-прототипе[Weissbach Н. et al., 1960] используется более низкая концентрация кинурамина – 0,11 мМ,что, согласно литературным данным, не обеспечивает насыщения МАО [Горкин В. З., 1981].К 0,73-0,75 мл раствора кинурамина (0,192-0,198 мМ) добавляли супернатант гомогенататкани до получения общего объема 0,76 мл с конечной концентрацией белка 0,016-0,375 мг/мли тщательно перемешивали. В холостую пробу вместо биологического материала вносилираствор сахарозы в фосфатном буфере, использовавшийся для приготовления гомогенатов.Инкубацию проводили при +37 0С, периодически измеряя оптическую плотность при 327 нм.Для исследования вклада изоферментов МАО в общую кинураминоксидазную активностьпроводилиподбороптимальнойконцентрацииингибитораМАОR-депрениладля специфического ингибирования изоформы типа В с тем, чтобы по разнице между общей(МАО А + МАО В) и остаточной активностями (МАО А) судить о работе ингибируемогоизофермента.
Для этого использовали следующие конечные концентрации R-депренилав реакционной смеси: 8,0; 4,0; 2,0; 1,0 и 0,5 мкМ.Содержание общего белка в реакционной смеси определяли после окончания инкубациипо методу Вера [Vera J. C., 1988].2.13. Определение содержания общего белка в структурах мозга и в реакционной смеситурбидиметрическим методомИспользование турбидиметрического метода определения содержания общего белкав биологических материалах, известного как метод Вера [Vera J. C., 1988], вызванонеобходимостью концентрирования анализируемой пробы и внесения практически всего107супернатанта, полученного при предварительной обработке гомогенатов микроструктур мозга,в хроматографическую колонку (с учетом хроматографирования параллельных образцов)или в реакционную среду для определения ферментативной активности.В основу данного метода положено измерение при 340 нм оптической плотности,развивающейся в результате добавления к щелочному раствору белка равного объема30% раствора трихлоруксусной кислоты.
Пригодность этого метода для использованияв настоящем исследовании была подтверждена нами посредством изучения его точностии чувствительности. Показатель точности опыта Р при четырех параллельных определенияхсоставил 0,49%. Поскольку эмпирическое значение Р значительно меньше 2%, определениявыполняются при помощи данного метода с высокой точностью [Матюшичев В.
Б., 1990].Содержаниеобщегобелкавреакционнойсмеси,вкоторойоценивалимоноаминооксидазную активность, определяли после окончания инкубации, регистрируяоптическую плотность при 500 нм вместо 340 нм во избежание влияния присутствиякинурамина при более коротких длинах волн. При этом широко используемый метод Лоури[Lowry O. H. et al., 1951] не позволяет исследовать содержание белка в реакционной смесипо причине взаимодействия кинурамина с реактивами, применяемыми в вышеупомянутомметоде, с развитием синего окрашивания.2.14. Статистическая обработка результатовСтатистическую обработку данных выполняли в среде интегрированных пакетовстатистических программ STATISTICA 5.0 и EXCEL общепринятыми методами вариационнойстатистики [Лапач С. Н., Чубенко А.
В., Бабич П. Н., 2001; Зайцев В. М., Лифляндский В. Г.,Маринкин В. И., 2006]. Данные представлены в следующем виде: среднее арифметическое средняя ошибка среднего арифметического (Мm). Для определения статистическойзначимости полученных результатов были использованы: параметрический t-критерийСтьюдента (t-тест), непараметрический U-критерий Манна-Уитни (U-тест), критерий согласияПирсона(2-тест).Достоверноразличающимисяпризнавализначенияприр<0,05;при 0,05<р<0,10 говорили о тенденции к изменению; при p>0,1 различия считалинедостоверными.
Наличие суточных ритмов исследуемых показателей оценивали при помощинепараметрического Н-критерия Крускала-Уоллиса (Н-тест).108ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ3.1. Содержание гонадолиберина в медиальной преоптической области и срединномвозвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса и уровень половых гормонов в кровина различных стадиях эстрального циклаАнализ содержания ГнРГ в областях гипоталамуса, ответственных за синтез и секрециюэтого нейрогормона, не показал достоверных различий между его уровнями в утреннееи дневное время.
Так, в МПО гипоталамуса содержание ГнРГ на стадии проэструса составило:0,570,09 нг/мг белка в 3 ч ЦВ и 0,520,07 нг/мл белка в 9:30 ч ЦВ. Похожая картинанаблюдалась и в СВ-Арк гипоталамуса, где содержание нейрогормона составило: 41,35,1 нг/мгбелка в 3 ч ЦВ и 57,612,5 нг/мг белка в 9:30 ч ЦВ. Однако важно отметить, что в случаеСВ-Арк была заметна тенденция роста содержания нейрогормона ко времени егопреовуляторной секреции.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
