Диссертация (1144749), страница 25

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 25)

После выделения структуры замораживали в жидком азоте и хранилипри температуре –70 0С до начала анализа.После размораживания исследуемые структуры мозга гомогенизировали в 0,5 мл 0,1 Мхлорной кислоты, содержащей 0,05% калия метабисульфита, после чего отбирали 0,1 мл пробыдля определения содержания общего белка по методу Лоури [Lowry O. H. et al., 1951].Оставшийся гомогенат центрифугировали (10 000 g, 15 мин., +4 0С), осадок отбрасывали,а от супернатанта отбирали 0,05 мл для измерения интенсивности хемилюминесценции.Супернатант переносили в прибор для микрофильтрации и фильтровали через капроновыйфильтр с диаметром пор 0,2 мкм; фильтрат подвергали хроматографическому анализу в тот жедень.В отдельных сериях исследований исследуемые структуры мозга после размораживаниягомогенизировали в меньшем объеме (0,3 мл) 0,1 М хлорной кислоты, содержащей 0,05% калияметабисульфита, и центрифугировали (10 000 g, 15 мин., +4 0С). Осадок растворялив 0,2 мл 1 М натрия гидроксида для определения содержания общего белка по методу Вера[Vera J.

C., 1988], а супернатант переносили в прибор для микрофильтрации и фильтроваличерез капроновый фильтр с диаметром пор 0,2 мкм; фильтрат подвергали хроматографическомуанализу в тот же день.Для определения моноаминооксидазной активности ткань гомогенизировали в 0,32 Мрастворе сахарозы, приготовленном в 0,05 М фосфатном буфере (рН 7,4), и центрифугировали100(1 000 g, 10 мин., +4 0С). Осадок отбрасывали, а супернатант использовали для проведениямоноаминоксидазной реакции.Для определения содержания ГнРГ гипоталамические структуры гомогенизировалив 0,3 мл 0,1 М уксусной кислоты при температуре, близкой к 0 0С, после чего подвергалитермической обработке (10 мин., +100 0С) и центрифугировали (13 000 g, 15 мин., +4 0С).Осадок растворяли в 0,2 мл 1 М натрия гидроксида для определения содержания общего белкапо методу Вера [Vera J. C., 1988], а из супернатанта отбирали 90 мкл (в случае МПО,без последующего разведения) либо 20 мкл (в случае СВ-Арк, с последующим разведением0,1 М раствором уксусной кислоты в соотношении 1:10, v/v).

Полученные аликвоты осторожнонейтрализовали 1 М раствором натрия гидроксида (в соотношении 10:1, v/v) и разбавлялибуферомизтест-системыдлястандартизованногоиммуноферментногоопределениясодержания ГнРГ в биологических образцах (в соотношении 1:5, v/v). Из полученных растворовотбирали 50 мкл, которые использовали непосредственно для иммуноферментного определениясодержания нейропептида в гипоталамических структурах.2.5. Определение уровня гонадолиберина в структурах мозгаиммуноферментным методомТест-система Peninsula Laboratories, LLC предназначена для определения содержанияГнРГвбиологическихобразцах(ткань,плазмаисывороткакрови)методомиммуноферментного анализа.Твердофазный иммуноферментный анализ основан на конкуренции за сайты связываниясмоноклональнымиантигонадолибериновымиантителамимеждуГнРГвобразцеи биотинилированным ГнРГ.

После удаления ГнРГ, не связавшегося с планшетом, в ячейкидобавляется стрептавидин, меченный пероксидазой хрена. Активность пероксидазы измеряетсяспектрофотометрическим методом после добавления субстрата. Полученная абсорбция обратнопропорциональна концентрации ГнРГ в пробе.Измерение оптической плотности осуществляли при 450 нм, используя автоматическийфотометр для микропланшетов и стрипов ELx800 (BioTek Instruments, США).1012.6. Определение уровня половых гормонов в сыворотке кровирадиоиммунологическим методомУровень половых стероидов (эстрадиол, прогестерон) в сыворотке крови определялирадиоиммунологическимметодом.Характеристикиантисыворотоккэстрадиолуипрогестерону (их специфичность, рабочие титры) приведены в работе [Морозов В.

И. и соавт.,1988].В качестве радиоактивных лигандов использовали препараты гормонов, меченныетритием по четырем положениям стероидного кольца (1, 2, 6, 7) с удельной активностью 3,2-3,5ТБк/моль. Рабочие титры антисывороток подгоняли таким образом, чтобы в холостой пробесвязывалось 30-50% активности. Неспецифическое связывание в пробе без антисывороткисоставляло 2-4% от общей активности. Диапазоны концентраций для калибровочных кривыхсоставляли: для эстрадиола – от 5 до 250 пг на пробу, для прогестерона – от 25 до 800 пгна пробу.Уровень эстрадиола в сыворотке крови определяли после предварительной экстракциидиэтиловым эфиром, при этом 0,1-0,2 мл сыворотки экстрагировали с помощью 1-2 мл эфира.Водную часть замораживали, эфир сливали в пробирку для тестирования и выпаривали.К сухому остатку добавляли 0,1 мл 10 мМ фосфатного буфера (рН 7,4) и использовалив радиоиммунологической реакции.Уровень прогестерона в сыворотке крови определяли безэкстракционным методом.Для этого в радиоиммунологическом методе использовали кислый ацетатный буфер (pH 4,0),который инактивирует кортикостеронсвязывающий белок.

Ввиду высокого содержанияпрогестерона в сыворотке в анализ брали 5 мкл биологического образца, добавляли 0,1 млацетатного буфера и проводили радиоиммунологическую реакцию.К 0,1 мл испытуемой пробы (а также к 0,1 мл холостой пробы и 0,1 мл стандарта)добавляли 0,1 мл антисыворотки в рабочем титре и 0,1 мл раствора меченого гормона с общейактивностью 8 000-10 000 имп./мин. на пробу.

Содержимое пробирок тщательно перемешивалии инкубировали в течение 45 мин. при +37 0С. Адсорбцию меченого гормона, не связавшегосяс антисывороткой, проводили декстран-угольной смесью (0,25% активированного угляи 0,025% декстрана с молекулярной массой 110 кДа), добавляя ее в количестве 0,5 мл.После инкубации уголь осаждали центрифугированием (3 500 g, 10 мин.), для подсчетарадиоактивности надосадочную жидкость сливали в виалы со сцинтилляционной жидкостью,приготовленнойнатолуоле(0,4гдифенилоксазолаи0,04г1,4-ди-(5-фенил-2-оксазолилбензола) на 1 л толуола). Подсчет радиоактивности проводили на следующий деньна жидкостном сцинтилляционном счетчике LKB 1215 RackBeta (Wallac, Финляндия).1022.7.

Определение содержания биогенных аминов и их метаболитов в структурах мозгаметодом высокоэффективной жидкостной хроматографиис электрохимическим детектированиемДля анализа биогенных аминов и их метаболитов в различных биологических объектахв настоящее время используется метод высокоэффективной жидкостной хроматографиисэлектрохимическимдетектированием,обеспечивающийвысокуючувствительность,селективность и скорость анализа [Зех К., 1988].Количественное определение НА, ДА и его метаболита 3,4-ДОФУК, 5-ОТ и егометаболита 5-ОИУК в экстрактах структур мозга проводили методом обращеннофазовойвысокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием[Кудрин В.

С. и соавт., 1995].Хроматографическая система состояла из изократического насоса модели Maraphone-2(SSI, США), инжектора петлевого ввода типа Rheodyne (НПП «Биохром», Россия), дегазатораподвижной фазы SDU 2006 (Швеция) и устройства для термостатирования хроматографическихколонок (ООО «Элсико», Россия). Хроматографическое разделение биогенных аминов и ихметаболитов осуществляли на металлической колонке Reprosil 80 ODS-2 (1004 мм, 3 мкм;Dr. Maisch GmbH, ФРГ). Детектирование проводили на аналитической ячейке модели 5100АCoulochem II (ESA, США) при потенциале +0,65 В.Подвижнаяфазасодержала6мМцитратногобуфера,2мМнатрияэтилендиаминтетраацетата, 1,1 мМ натрия октилсульфоната и 7% ацетонитрила (v/v), рН 5,1.Расход элюента – 0,75 мл/мин, температура колонки – +30 0С.Стандартные растворы НА, ДА, 3,4-ДОФУК, 5-ОТ, 5-ОИУК и 3,4-диоксибензиламина(внутренний стандарт) в 0,1 М хлорной кислоты, содержащей 0,05% калия метабисульфита,готовили методом последовательных разбавлений.

Концентрации компонентов стандартнойсмеси находились в пределах величин, наблюдаемых в реальных образцах. Соотношениемежду вводимым количеством стандарта и откликом детектора было линейным для всехисследуемых веществ в диапазоне 0-500 нМ. Предел детектирования составил 0,05 нг.Количественные характеристики хроматографических пиков измерялись автоматическисистемой регистрации и обработки спектрометрической информации UniChrom 4.4 (ООО«Новые Аналитические Системы», Беларусь).Содержание определяемых веществ рассчитывали в нанограммах на миллиграмм общегобелка, который определяли по методу Лоури [Lowry O.

H. et al., 1951] или Вера [Vera J. C.,1988].103Для оценки состояния и функциональной активности моноаминергических систем мозгав исследуемых структурах мозга определяли изменение содержания соответствующихнейромедиаторов и их главных метаболитов, а также соотношение между ними.2.8. Определение уровня общего L-гомоцистеина в плазме кровииммуноферментным методомТест-система Axis Homocysteine EIA предназначена для определения концентрацииобщего ГЦ в крови методом иммуноферментного анализа. Связанный с белком ГЦвосстанавливаетсядосвободногоипревращаетсявS-аденозил-L-гомоцистеинферментативным путем в специальной процедуре, предшествующей иммуноанализу.

Ферментспецифичен для L-формы ГЦ, в которой последний и присутствует в крови.СмесьдисульфидаГЦибелок-связаннойформыаминокислотывобразцевосстанавливается до свободного ГЦ при использовании дитиотреитола. Высвободившийся ГЦобразца далее превращается в S-аденозил-L-гомоцистеин при участии S-аденозил-Lгомоцистеингидролазы в присутствии избытка аденозина. Следующий за этим твердофазныйиммуноферментный анализ основан на конкуренции за сайты связывания с моноклональнымианти-S-аденозил-L-гомоцистеиновымивобразцеиантителамиS-аденозил-L-гомоцистеином,междуS-аденозил-L-гомоцистеиномиммобилизованнымвячейкахпланшета.После удаления анти-S-аденозил-L-гомоцистеиновых антител, не связавшихся с планшетом,в ячейки добавляются вторые кроличьи антимышиные антитела, меченные пероксидазой хрена.Активность пероксидазы измеряется спектрофотометрическим методом после добавлениясубстрата.

Полученная абсорбция обратно пропорциональна концентрации общего ГЦ в пробе.Измерение оптической плотности осуществляли при 450 нм, используя автоматическийфотометр для микропланшетов и стрипов ELx800 (BioTek Instruments, США).2.9. Определение уровня генерации активных форм кислорода в структурах мозгаметодом люминолзависимой хемилюминесценцииОб уровне генерации АФК судили по уровню люминолзависимой перекиснойхемилюминесценции [Арутюнян А. В., Дубинина Е. Е., Зыбина Н.

Н., 2000].104Супернатант, отобранный после гомогенизирования исследуемых микроструктур мозга,разводили фосфатным буфером (1:9, v/v; рН 7,4), содержащим 60 мМ калия фосфатаоднозамещенного и 105 мМ калия хлорида, и хранили до начала анализа при –20 0С.После размораживания к 100 мкл разведенного супернатанта добавляли 650 мкл фосфатногобуфера и 50 мкл 10 мМ люминола. Приготовленную реакционную смесь помещали в кюветулюминометра Emilite-1105 (ООО «БиоХимМак», Россия). Для инициации свечения в пробус помощью шприца вносили 0,2 мл раствора водорода пероксида (Е230=2,33). Свечениеизмеряли в течение 2 мин. при +37 0С и определяли светосумму в относительных единицах(1 отн. е.

Характеристики

Список файлов диссертации