Диссертация (1144749), страница 24
Текст из файла (страница 24)
В некоторых случаях содержание биогенных аминов определялитакже и в других гипоталамических структурах, а именно в СХЯ и сером бугре (СБ).Декапитацию животных производили на стадии проэструса или диэструса с началом в 5 ч,9:30 ч и 11 ч циркадианного времени (ЦВ) или, в зависимости от условий эксперимента,в другое время (конкретные временные точки в каждой из экспериментальных серий указаныв гл. 3). ЦВ отсчитывали от начала дневной фазы экспериментальных суток, искусственноподдерживаемых в виварии; под временными точками здесь и далее понимали временныепромежутки с началом декапитации в указанное время, при этом общее время декапитацииживотных, ограниченное одним временным промежутком, не превышало 40 мин.
Стадииэстрального цикла животных в день декапитации определяли по соотношению клеток трехтипов, присутствующих во влагалищных мазках [Marcondes F. K., Bianchi F. J., Tanno A. P.,2002]. Правильность определения стадий эстрального цикла подтверждали post mortem, измеряямассу яичникови визуально оценивая степень обводненности матки.96Нелетучий ксенобиотик ДМГ вводили внутрибрюшинно, однократно, утром (в 3 ч ЦВ),накануне дня проэструса, в дозе 21 мг/кг массы (в расчете на основание), растворенныйex tempore в физиологическом растворе.Для проведения ингаляции толуола животных помещали в специальные затравочныекамеры, сконструированные на базе блоков типа 1КА-НЖ.
Схема затравочных камерпредставлена на рисунке 2.1. Емкость камер – 400 л. Скорость подачи воздуха в камеры –30 л/мин. Животные подвергались воздействию паров ксенобиотика на заданном уровне1 – камера; 2 – вентилятор; 3 – вакуумный насос; 4 – реометр выходной;5 – барботажный сосуд; 6 – реометр дозирующий; 7 – реометр шунтирующийРисунок 2.1 – Схема работы затравочной камерыв течение 4 ч в день по 5 дней в неделю на протяжении 2 мес. Концентрацию толуола в камерахподдерживали на уровне предельно допустимой концентрации (ПДК), установленнойгигиенистами для воздуха рабочей зоны промышленных предприятий (50 мг/м3).
Дозировкуксенобиотика осуществляли весовым методом. Расчет концентрации паров проводилипо формуле:А/(ВС), где:А – масса испарившегося вещества, мг;В – продув воздуха, м3/ч;С – время испарения, ч.Вовремяингаляциибылообеспеченопродуваниекамер,достаточноедля поддержания концентрации кислорода и углекислого газа на физиологическом уровне.При проведении экспериментов фиксировалась температура, влажность и давление воздуха97внутри камер. Животных контрольной группы помещали в такие же камеры, но без подачив них ксенобиотика. После каждого сеанса ингаляции животных возвращали в виварий.Мелатонин вводили вечером (в 10 ч ЦВ) в дозе 1 мг/кг массы. Пептидные биорегуляторыэпиталамин, эпиталон и пинеалон [Хавинсон В. Х., 2001] вводили днем (в 6 ч ЦВ) в дозе 1 мг/кгмассы, 2 мкг/кг массы и 10 мкг/кг массы, соответственно.
Все препараты растворялив физиологическом растворе и вводили внутрибрюшинно, ежедневно в течение 4 дней,предшествовавших дню декапитации, в объеме 0,25 мл. Дозы и режим введения пептидныхпрепаратов были разработаны и изучены в работах [Морозов В. Г., Хавинсон В. Х., 1996;Хавинсон В. Х., Морозов В.
Г., 2001; Хавинсон В. Х., Анисимов В. Н., 2003].Водный раствор L-метионина вводили перорально, ежедневно в течение 30 дней,в количествах, необходимых для получения животными суточной дозы 0,12-0,15 г в расчетена животное. Исходя из полученных нами ранее данных о том, что принудительноепероральное введение L-метионина самкам крыс приводит к более выраженному повышениюуровня общего ГЦ в сыворотке крови, чем потребление L-метионина с питьевой водой[Арутюнян А. В. и соавт., 2012], в настоящем исследовании была выбрана экспериментальнаямодель ГГЦ с пероральным введением L-метионина.Для определения уровня общего ГЦ в крови забор материала осуществляли в вакуумныепробирки Vacuette® с антикоагулянтом калия этилендиаминтетраацетатом (К3EDTA, GreinerBio-One GmbH, Австрия). Так как ГЦ продолжает синтезироваться в эритроцитахи после забора крови, забранный материал центрифугировали настолько быстро, насколько этобыло возможно, после чего оставляли на льду до начала анализа.Исследование влияния на экспериментальных животных световой депривации проводили,как описано ниже.
Животные, первоначально содержавшиеся достаточно длительное время(2-3 нед.) в условиях стандартного фиксированного освещения, помещались на трое сутокв условия световой депривации. Длительность пребывания животных в этих условиях былавыбрана в соответствии с описанными в литературе подходами к изучению циркадианнойприроды суточных ритмов [Cagampang F. R., Okamura H., Inouye S., 1994; Jamali K.
A.,Tramu G., 1999]. Считается, что в течение трех суток в условиях световой депривации суточныеритмы, связанные с изменением освещенности, полностью исчезают, но при этом ещенепроисходитсдвигафазыэндогенныхциркадианныхритмов,чтонаблюдаетсяпри помещении животных в темноту на более длительный срок. Для описания временидекапитации животных, находившихся в условиях световой депривации, использовали понятия«условный день» и «условная ночь», соответствующие светлому и темному времениастрономических суток, в условиях циклической смены которых животные содержалисьдо помещения их в условия световой депривации.98Исследование влияния на экспериментальных животных постоянного освещенияв сочетании с применением мелатонина и эпиталона проводили следующим образом.В эксперименте использовали животных в возрасте 3, 5, 8, 11, 14, 17, 20 и 23 мес. Исследованиепроводили до естественной гибели животных.
В данной экспериментальной серии изучалиследующие показатели: средняя продолжительность эстрального цикла, количество эстральныхциклов разной продолжительности и их процентное соотношение, процентное соотношение фазэстрального цикла, относительное число животных с иррегулярными циклами. Стадииэстрального цикла в этих исследованиях определяли, начиная с трехмесячного возраста,каждые три месяца ежедневно в течение двух недель.В 25-дневном возрасте все животные данной серии были рандомизированно разделенына две группы. Первая группа находилась в условиях стандартного фиксированного освещения.Вторая группа животных содержалась при круглосуточном постоянном освещении.В возрасте 4 мес.
животных каждой из двух групп рандомизированно делили на триравные подгруппы. Животные первой подгруппы получали на протяжении всей последующейжизни в течение пять дней в неделю в ночное время суток (с 19.00 ч до 07.00 ч) вместес питьевой водой мелатонин в дозе 10 мг/л [Pierpaoli W., Maestroni G. J., 1987]. Животнымвторой подгруппы ежемесячно курсами по пять дней в неделю подкожно утром (в 3 ч ЦВ)вводили эпиталон в количестве 0,1 мкг на животное в 0,1 мл физиологического раствора.Животные третьей подгруппы являлись контрольными.
В этой подгруппе выделялись двечасти: одни контрольные животные получали инъекцию физиологического раствора в те жечасы, когда производилась инъекция эпиталона, другие – питьевую воду в ночное время суток.Поскольку изучаемые показатели у интактных животных, содержавшихся в условиях вивария,и у контрольных животных, которым вводили физиологический раствор, не имелистатистически достоверных отличий, данные по ним были объединены и представленыкак данные одной контрольной группы.Исследование влияния возраста экспериментальных животных на содержание биогенныхаминов в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию ГнРГ, включало в себячетыре возрастные группы.
Первую группу составили животные в возрасте 1,5 мес. Данныйвозраст характеризуется открытием влагалища и формированием эстральных циклов. Втораягруппа животных состояла из половозрелых, регулярно циклирующих самок в возрасте 7-8 мес.В третьей группе животных находились самки в возрасте 13-14 мес., при котором ещевстречаются отдельные эстральные циклы, но уже наблюдается удлинение стадий диэструсаи (или) эструса. Четвертую группу животных составили самки в возрасте 24 мес. и старше,в котором половая цикличность полностью прекращается и животные находятся в состоянииперсистирующего эструса или диэструса.99Количество животных в контрольной и опытных группах в каждой из экспериментальныхсерий указано в гл. 3.2.4.
Выделение и препарирование структур мозга, осуществляющих регуляциюэстральных цикловИз мозга декапитированных животных выделяли гипоталамические структуры (МПО,СВ-Арк,СХЯ,СБ).Топографическаяидентификацияанатомическихобразованийосуществлялась с использованием атласов анатомии головного мозга крыс [Paxinos G.,Watson C., 2007] или как описано ранее [Савченко О. Н., Данилова О. А., 1979]. Ориентируясьна оптическую хиазму, делали фронтальный срез мозга до и после нее толщиной около 1 мм.Из него извлекали МПО гипоталамуса – участок треугольной формы массой 2-3 мг,а из следующего среза толщиной 0,8 мм выделяли фрагмент, содержащий СХЯ гипоталамуса.Фрагмент, содержащий СВ-Арк гипоталамуса, массой около 1 мг, выделяли из СБгипоталамуса.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
