Диссертация (1141401), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Оценка пригодности системы бутанол/ледяная уксусная кислота/вода(6:3:2) для качественного анализа ЛФ борхлорина:1 – исследуемый образец ЛФ (борхлорин 0,4 мкг, холестерин 12,8 мкг),2 – СОВС-1 (борхлорин 0,4 мкг), 3 – СОВС-3 (холестерин 12,8 мкг),4 – СОВС-1 (борхлорин 0,1 мкг) и 5 – СОВС-3а (холестерин 1,0 мкг)Такимобразом,хроматографическуюсистемубутанол/ледянаяуксусная кислота/вода (6:3:2) можно считать пригодной, если на пластинкенапротив СОВС-1 (борхлорин 0,1 мкг) видно округлое пятно светло-зеленогоцвета, а напротив СОВС-3а (холестерин 1,0 мкг) при проявлении 20% сернойкислотой обнаруживается пятно розового цвета.134Оценкапригодностисистемыхлороформ/этанол/ледянаяуксуснаякислота/ацетон/вода (6:2:2:1:1)Приготовление исследуемого образца ЛФ борхлоринаК 2 мл регидратированной ЛЛФ-лио борхлорина (содержимое флаконарастворяют в 3,7 мл воды) прибавляют 3 мл спирта 95% и перемешивают.Приготовление СОВС:СОВС-2 – спиртовой раствор ФХ 18 мг/мл.
Приведено в разделе 4.1.1.СОВС-2а – спиртовой раствор ФХ 1 мг/мл. Навеску ФХ 18,0 мг растворяютв 18 мл спирта 95%.Подготовка йодной камеры. Приведена в разделе 4.1.1.Методика проведения анализаНа линию старта хроматографической пластинки наносят пробы: 1 – 4мкл исследуемого образца ЛФ (ФХ 72,0 мкг), 2 – 4 мкл СОВС-2 (ФХ 72,0мкг), 3 – 1 мкл СОВС-2а (ФХ 1,0 мкг). После подсушивания на воздухепластинку с нанесенными пробами помещают в хроматографическую камерусосмесьюхлороформ/этанол/ледянаяуксуснаякислота/ацетон/вода(6:2:2:1:1), плотно закрывают крышкой и хроматографируют восходящимспособом. После достижения фронтом элюента линии финиша пластинкувынимают из камеры и высушивают в потоке теплого воздуха до полногоудаления запаха растворителя. Борхлорин проявляется в виде зеленого пятнабез использования специфических реактивов.
Для обнаружения ФХпластинку помещают в камеру, насыщенную парами йода, и выдерживаютоколо 1 мин до появления ярко-желтых пятен ФХ. Совместно с ФХпроявляются светло-желтые быстро исчезающие пятна холестерина.Припроверкепригодностисистемыхлороформ/этанол/ледянаяуксусная кислота/ацетон/вода (6:2:2:1:1) значения Rf составили (Рисунок 43):1 – исследуемый образец ЛФ: борхлорин – 0,91, ФХ (72,0 мкг) – 0,48;2 – СОВС-2 (ФХ 72,0 мкг) – 0,47;1353 – СОВС-2а (ФХ 1,0 мкг) – 0,48.Рисунок 43.
Оценка пригодности системы хлороформ/этанол/ледяная уксуснаякислота/ацетон/вода (6:2:2:1:1) для качественного анализа ЛФ борхлорина:1 – исследуемый образец ЛФ (ФХ 72,0 мкг), 2 – СОВС-2 (ФХ 72,0 мкг),3 – СОВС-2а (ФХ 1,0 мкг)Хроматографическую систему хлороформ/этанол/ледяная уксуснаякислота/ацетон/вода (6:2:2:1:1) можно считать пригодной, если на пластинкенапротив СОВС-2а (ФХ 1,0 мкг) при проявлении парами йода детектируетсяпятно желтого цвета.Оценка пригодности системы ацетон/ледяная уксусная кислота/вода(15:3:2)Приготовление исследуемого образца ЛФ борхлорина.
Приведено в разделе4.1.4.Приготовление СОВС:СОВС-4 – водный раствор сахарозы 1 мг/мл. Приведено в разделе 4.1.4.СОВС-4а – водный раствор сахарозы 0,1 мг/мл. Навеску сахарозы 10,0 мграстворяют в 100 мл воды.Приготовление раствора α-нафтола. Приведено в разделе 4.1.4.Методика проведения анализа136На линию старта хроматографической пластинки наносят пробы: 1 – 2мкл исследуемого образца ЛФ (сахароза 2,0 мкг), 2 – 2 мкл СОВС-4 (сахароза2,0 мкг), 3 – 1 мкл СОВС-4а (сахароза 0,1 мкг).
После подсушивания навоздухепластинкухроматографическуюскамерунанесеннымисосмесьюпробамипомещаютацетон/ледянаявуксуснаякислота/вода (15:3:2), плотно закрывают крышкой и хроматографируютвосходящим способом. После достижения фронтом элюента линии финишапластинку вынимают из камеры и высушивают в потоке теплого воздуха дополного удаления запаха растворителя. Пластинку опрыскивают растворомα-нафтола и нагревают в сушильном шкафу до появления темно-фиолетовыхпятен сахарозы.Припроверкепригодностисистемыацетон/ледянаяуксуснаякислота/вода (15:3:2) значения Rf составили (Рисунок 44):1 – исследуемый образец ЛФ: сахароза (2,0 мкг) – 0,55;2 – СОВС-4 (сахароза 1,0 мкг) – 0,55;3 – СОВС-4а (сахароза 0,1 мкг) – 0,54.Рисунок 44.
Оценка пригодности системы ацетон/ледяная уксусная кислота/вода(15:3:2) для качественного анализа ЛФ борхлорина: 1 – исследуемый образец ЛФ(сахароза 2,0 мкг), 2 – СОВС-4 (сахароза 2,0 мкг), 3 – СОВС-4а (сахароза 0,1 мкг)137Таким образом, хроматографическую систему ацетон/ледяная уксуснаякислота/вода (15:3:2) можно считать пригодной, если на пластинке напротивСОВС-4а (сахароза 1,0 мкг) при проявлении раствором α-нафтолаобнаруживается пятно розово-фиолетового цвета.4.2. Разработка методики спектрофотометрического анализа борхлоринав ЛЛФ и ЛЛФ-лио.4.2.1.Изучениеспектральныххарактеристикборхлоринаиегоидентификация (определение подлинности) в ЛФВ электронном спектре поглощения спиртового раствора субстанцииборхлорина в диапазоне от 200 до 800 нм обнаружено 4 основныхмаксимума: (217±2), (400±2), (499±2) и (662±2) нм (Рисунок 45).Рисунок 45.
Электронный спектр поглощения спиртового раствора субстанцииборхлорина (концентрация борхлорина в растворе 2 мкг/мл)На Рисунке 46 показано, что спектр поглощения спиртового растворалипосомального борхлорина в диапазоне 300-800 нм идентичен спектрупоглощения субстанции борхлорина по положению максимумов и формекривой. Таким образом, электронный спектр поглощения липосомальногоборхлорина может применяться для определения подлинности борхлорина вЛФ.138Рисунок 46.
Электронный спектр поглощения спиртового раствора липосомальногоборхлорина (концентрация борхлорина в растворе 2 мкг/мл)4.2.2.ИзучениевлиянияспектрофотометрическоевспомогательныхопределениеборхлоринавеществвЛФна(оценкаспецифичности)Для изучения влияния вспомогательных веществ на абсорбционныехарактеристики борхлорина в ЛЛФ и ЛЛФ-лио исследовали спектрпоглощения «пустых» липосом. В диапазоне 200-300 нм обнаружены 2 пика– при (267±2) и (279±2) нм, соответствующих максимумам поглощениявспомогательных ингредиентов ЛФ (Рисунок 47).Рисунок 47. Электронный спектр поглощения «пустых» липосом139В диапазоне спектра от 300 до 800 нм показано, что вспомогательныекомпоненты исследуемой ЛФ, а также используемый растворитель непоглощают излучение в области максимумов борхлорина и таким образом невлияют на спектральные характеристики ФС.Исходяизвышеизложенного,электронныйспектрпоглощениялипосомального борхлорина может использоваться для идентификации иколичественного определения борхлорина в ЛЛФ и ЛЛФ-лио, а применяемаяметодикаспектрофотометрическогоанализаборхлоринаявляетсяспецифичной.На Рисунке 48 представлены совмещенные спектры поглощенияспиртовых растворов субстанции борхлорина, ЛЛФ-лио борхлорина и«пустых» липосом.Рисунок 48.
Спектры поглощения:1 – субстанции борхлорина (концентрация борхлорина в растворе 3 мкг/мл),2 – ЛЛФ-лио борхлорина (концентрация борхлорина в растворе 2 мкг/мл),3 – «пустых» липосом4.2.3.Определениемаксимумапоглощениядляколичественногоспектрофотометрического анализа борхлорина в ЛФ.В качестве аналитической выбирали длину волны, при которой пикборхлорина имеет наибольшее разрешение и интенсивность.
Для анализаборхлорина в разработанной ЛФ наиболее удобно использовать полосу140поглощения средней интенсивности с максимумом около (662±2) нм,поскольку данный пик является разрешенным, узким и позволяет измерятьоптическуюплотностьконцентрированныхлипосомальныхдисперсийборхлорина.4.2.4. Оценка соблюдения закона Бугера–Ламберта–БераПри проверке соблюдения закона Бугера-Ламберта-Бера установлено,что поглощение спиртового раствора борхлорина при длине волны 662 нмподчиняется данному закону. На Рисунке 49 показана линейная зависимостьзначения оптической плотности от концентрации борхлорина во всемисследуемом интервале концентраций от 2 до 20 мкг/мл.
Оптическаяплотность спиртовых растворов борхлорина находилась в пределах 0,2-0,8при концентрации борхлорина 4-14 мкг/мл.Рисунок 49. Оценка соблюдения закона Бугера–Ламберта–Бера спиртового раствораборхлорина при длине волны 662 нм4.2.5.Количественноеопределениеборхлоринавлипосомальнойдисперсии до и после лиофилизацииОптическую плотность анализируемых растворов измеряли при длиневолны (662±2) нм с использованием в качестве раствора сравнения спирта95%.Концентрацияисследуемыхспиртовыхрастворовборхлоринаподобрана таким образом, чтобы оптическая плотность находилась в области141значения 0,5. При этом количественное определение борхлорина проводилипри его концентрации в растворе около 8 мкг/мл.Приготовление СО борхлоринаК точной навеске субстанции борхлорина 1,0 мг добавляют 10 млспирта 95% и помещают в УЗ-ванну на 5-10 мин.
Полученный спиртовойраствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл идоводят спиртом до метки (раствор А). Отбирают 5 мл раствора А в колбувместимостью 25 мл и доводят спиртом до метки (раствор Б). Раствор Биспользуют свежеприготовленным.А. Методика спектрофотометрического определения борхлорина в ЛЛФ.4 мл липосомальной дисперсии борхлорина помещают в мерную колбувместимостью 25 мл и добавляют небольшое количество спирта 95%,перемешивают, доводят спиртом до метки и перемешивают (раствор А).
5 млраствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят спиртомдо метки и перемешивают (раствор Б). Измеряют величину оптическойплотности раствора Б в кюветах с толщиной оптического слоя 10 мм вмаксимуме поглощения относительно раствора сравнения. Параллельнопроводят измерение оптической плотности раствора СО субстанцииборхлорина относительно раствора сравнения.Концентрацию борхлорина в ЛЛФ (Х, мг/мл) рассчитывают поформуле (разведения одинаковы):Х= А×а0/ А0×4,где: А и А0 – оптические плотности растворов образца ЛЛФ и СОборхлорина соответственно; а0 – навеска СО борхлорина, в мг; 4 – 4 млобразца ЛЛФ борхлорина.Относительная ошибка определения борхлорина в ЛЛФ по даннойметодикесоставила0,71%,чтоуказываетразработанной методики анализа (Таблица 19).навысокуюточность142Таблица 19Результаты количественного определения борхлорина в ЛЛФ№ образца ЛЛФОптическая плотность, Концентрация борхлорина вборхлоринаАобразце ЛЛФ, мг/мл10,4670,27820,4700,28030,4720,28140,4740,28250,4690,27960,4760,2832-6Статистическиеn=6, f=5, хср=0,281, S =3,8×10 , S=1,9×10-3,характеристики Sхср.=7,8×10-4, t (Р, f)=2,57 (P=95%), ∆х=0,002, ε=0,71 %Б.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
