Диссертация (1141401), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Однако оптимальный размер носителей, обеспечивающихпассивный транспорт ЛВ в опухолевую ткань, попадает в интервал 100-200нм. Поэтому для измельчения и получения более однородных по размерулипосом борхлорина с высоким уровнем включения были предложенынаиболеераспространенныеиспользованиемметодыфильтрующих–экструзиямембран,поддавлениемобработкаУЗсигомогенизация/микрофлюидизация. Целью данного исследования являлсявыбор оптимального способа получения ОСЛ борхлорина приемлемогоразмеранаоснованиисравнительнойоценкикачестваполучаемыхлипосомальных дисперсий. Метод экструзииРазмер везикул при экструдировании главным образом определяетсядиаметром пор фильтрующих мембран и количеством циклов пропусканиядисперсии через фильтр.
Также на размер везикул может влиять типматериала используемых фильтров. Поэтому при выборе оптимальногорежима экструзии липосом борхлорина оценивали эффективность двух типовфильтрующих мембран – поликарбонатных с диаметром пор 0,2 мкм инейлоновых с диаметром пор 0,22 мкм.Согласно результатам, представленным в Таблице 4, экструзия сиспользованием поликарбонатного фильтра позволяет получить устойчивуюлипосомальную дисперсию с оптимальным размером везикул.
Уже при 1кратном пропусканиидисперсииМСЛ борхлорина размерлипосом94уменьшился с 215 до 172 нм, а при 4-кратном – до 155 нм. При этом данныедисперсии оставались стабильными в течение 2-х суток хранения притемпературе +2...+8ºС (Рисунок 24А, 24Б).Таблица 4Размер липосом борхлорина при экструзии с поликарбонатнымфильтром с диаметром пор 0,2 мкмРазмер липосом, нм (распределение по фракциям, %)Сутки0120215±14*221±10*209±10*1172±10*168±5*174±5*2160±7*168±8*170±7*3152±4*166±8*175±6*4155±4*166±6*165±5*5153±6*167±6*163±5 (97%)/57±4 (3%)6155±9*161±10*175±8 (92%)/71±3 (8%)7144±5*154±7 (96%)/43±3 (4%)171±6 (97%)/42±5 (3%)8145±8*157±6 (97%/52±3 (3%)170±8 (96%)/44±5 (4%)9142±5*153±6 (99%)/22±4 (1%)233±10 (83%)/60±8 (17%)10150±4*157±7 (99%)/28±3 (1%)213±9 (88%)/49±8 (12%)Примечание: * одна фракция (100%)ЧислоцикловАБРисунок 24.
Средний размер везикул после экструзии с поликарбонатным фильтром:А – после 1-кратного пропускания – 172 нм,Б – после 4-кратного пропускания – 155 нмДальнейшая экструзия позволила уменьшить диаметр липосом до 140нм, однако полученные везикулы имели склонность к слиянию и в процессехранения укрупнялись до 233 нм (Таблица 4, Рисунок 25).95Рисунок 25. Средний размер везикул после 9-кратной экструзиис поликарбонатным фильтром –142 нм.В результате последовательного пропускания через нейлоновыйфильтрпервоначальнонаблюдалипостепенноеуменьшениеразмералипосом. Однако достигнув после 5 циклов минимального значения – 180 нм,при дальнейшем измельчении отмечали образование более крупных поразмеру везикул (Рисунок 26, Таблица 5).
На протяжении 2-х сутокполученные дисперсии сохраняли стабильность и лишь в некоторых случаяхотмечалось незначительное укрупнение везикул.Рисунок 26. Средний размер везикул после 5-кратной экструзиис нейлоновым фильтром – 180 нм96Таблица 5Размер липосом борхлорина при экструзии с нейлоновым фильтром сдиаметром пор 0,22 мкмРазмер липосом, нм (распределение по фракциям, %)Сутки0120223±15*227±12 (98%)/34±5 (2%)206±10*1213±12*193±9*204±6*2197±10*200±7*206±8*3192±8*196±6*209±8 (99%)/28±3 (1%)4185±8*182±5*194±8*5180±8*176±5*179±8*6190±8*196±6*206±7*7188±10*202±10*205±6*8194±10*185±8 (95%)/68±3 (5%)188±7 (99%)/34±3 (1%)9198±9*194±10 (99%)/35±4 (1%)197±8*10184±6*187±8*190±7*Примечание: * одна фракция (100%)ЧислоцикловПри оценке способа измельчения помимо размера везикул важнымпараметром качества липосомальной дисперсии является ЭВ действующеговеществавлипосомы.Установлено,чтоприиспользованииполикарбонатных фильтров с уменьшением диаметра липосом наблюдаетсязначительноеснижениевключенияборхлорина.После1-кратногопропускания потери борхлорина составили 4%, а после 4-кратной экструзииоколо 7% (Таблица 6).
При этом не включившееся вещество, сорбируясь нафильтре, существенно затрудняло процесс дальнейшей экструзии.В отличие от поликарбонатных фильтров использование нейлоновыхфильтров для получения ОСЛ борхлорина обеспечивает сохранениевысокого уровня включения борхлорина: при 5-кратном пропускании потеридействующего вещества составляли не более 2% (Таблица 6).97Таблица 6Эффективность включения борхлорина в липосомы при экструзии споликарбонатным и нейлоновым фильтромЧислоциклов123456ЭВ, %Тип фильтраполикарбонатный (поры 0,2 мкм)нейлоновый (поры 0,22 мкм)96±1,095±1,299,0±1,094±1,093±1,098,0±1,092±0,5На основании полученных результатов, для измельчения МСЛборхлорина были выбраны нейлоновые мембранные фильтры с диаметромпор 0,22 мкм, которые обеспечивают при 5-кратной экструзии получениевезикул приемлемого размера и с высоким уровнем включения борхлорина влипосомы.С целью получения более мелких везикул после экструзии снейлоновым фильтром дисперсию ОСЛ экструдировали с использованиемполивинилиденфторидового фильтра с диаметром пор 0,1 мкм.
При 1кратном пропускании дисперсии через данный фильтр размер везикулуменьшился до 153 нм, а после повторного пропускания размер липосомпрактически не изменился и составил в среднем 155 нм (Рисунок 27А).АБРисунок 27. Распределение везикул по размерам после экструзии споливинилиденфторидовым фильтром: А – сразу после экструзии – фракция липосом сосредним диаметром 153 нм, Б – спустя 2 суток – фракции липосом со средним диаметром234 и 53 нм.98Однако получаемые дисперсии оказались нестабильны: в процессехранения отмечалось образование двух фракций везикул и рост диаметравезикул преобладающей фракции (92-96%) до 234-236 нм (Рисунок 27Б,Таблица 7).Кроме того, при экструзии на фильтре наблюдали наличие небольшогоосадка борхлорина и по результатам количественного анализа былоустановлено, что ЭВ значительно снизилась и составила 92-93% (Таблица 7).Поэтому поливинилиденфторидовые фильтры с диаметром пор 0,1 мкм неиспользовались при получении ОСЛ борхлорина.Таблица 7Качество ЛЛФ борхлорина при экструзии с поливинилиденфторидовымфильтром с диаметром пор 0,1 мкмРазмер липосом, нм (распределение по фракциям, %)Сутки0120180±8*176±5*181±8*1153±6*182±12*234±11 (96%)/53±4 (4%)2155±4*201±10 (99%)/15±3 (1%)236±8 (92%)/67±5 (8%)Примечание: * одна фракция (100%)ЧислоцикловЭВ,%98,0±1,093,0±1,092,0±1,0В ходе эксперимента также установлено, что экструзия практически неприводит к нагреванию липосомальной дисперсии и не влияет на значениерНдисперсии.Потерилипосомальнойдисперсиивпроцессеэкструдирования незначительны: при измельчении 30-40 мл дисперсии непревышают 5%. Метод УЗ-обработкиИногда вместо экструзии для измельчения липосом применяют УЗобработку.
Размер получаемых везикул зависит от объема обрабатываемойлипосомальной дисперсии и времени воздействия УЗ.Дисперсию МСЛ борхлорина объемом 30 мл диспергировали от 15 до60 мин с отбором проб через определенные промежутки времени.99Результаты, представленные в Таблице 8, показывают, что сувеличением времени озвучивания дисперсии наблюдалось постепенноеуменьшение диаметра липосом. Спустя 30-45 мин измельчения липосомыимели средний размер 193-194 нм, которые сохраняли стабильность втечение 2-х суток при +2...+8°С (Рисунок 28А, 28Б).АБРисунок 28.
Средний размер везикул спустя 30 минут УЗ-обработки:А – сразу после измельчения – 194 нм, Б – спустя 2 суток – 184 нмТаблица 8Влияние УЗ на качество липосомальной дисперсии борхлоринаРазмер липосом, нм(распределение по фракциям, %)t дисп, °ССутки012021,0±0,2251±20*254±20*255±18*237±18 (99%)/ 210±12 (99%)/ 232±13 (99%)/1529,2±0,314±6 (1%)11±4 (1%)11±7 (1%)428±15 (89%)/ 406±12 (90%)/2030,6±0,3228±14*80±10 (11%)68±10 (10%)183±8 (99%)/185±12 (99%)/2532,2±0,2204±18*11±3 (1%)11±5 (1%)3033,5±0,3194±16*195±8*184±3*189±8 (99%)/4536,3±0,2193±8*185±6*11±3 (1%)192±10 (99%)/ 314±12 (93%)/ 443±20 (85%)/6038,7±0,412±3 (1%)55±10 (7%)76±8 (15%)Примечание: * одна фракция (100%)ВремявоздействияУЗ, минЭВ, %99,0±1,097,0±1,094,0±1,193,0±1,092,0±1,0100Дальнейшая обработка дисперсии УЗ до 60 мин не привела кобразованиюболеемелкихвезикул–среднийразмерлипосомпреобладающей фракции (99%) составил 192 нм (Рисунок 29А).
Однакоданные везикулы в процессе хранения сливались и через 2-е суток имелисредний диаметр 443 нм (Рисунок 29Б, Таблица 8).БАРисунок 29. Распределение везикул по размерам спустя 60 минут УЗ-обработкиА – сразу после измельчения – фракции липосом со средним диаметром 192 и 12 нм,Б – спустя 2 суток – фракции липосом со средним диаметром 443 и 76 нм.На протяжении всего процесса УЗ-обработки наблюдали постепенноенагреваниелипосомальнойдисперсии.За60миндиспергированиятемпература дисперсии увеличилась практически в 2 раза от начальногозначения – с 21,0±0,5 до 38,7±0,4. При этом показатель рН увеличился с 6,1до 6,8, а ЭВ снизилась до 94% после 30 мин УЗ-обработки и до 92% после 60мин.Снижение качества дисперсии при УЗ-обработке вероятно обусловленовоздействием УЗ и нагреванием дисперсии, приводящих к частичнойдеструкции липидов, входящих в состав липосомальной мембраны.Таким образом установлено, что УЗ-обработка дисперсии борхлоринаотрицательно влияет на качество липосомального препарата, вызываяизменения показателя рН, снижение включения ФС и увеличение размероввезикул.
В связи с этим данный метод не использовался при приготовленииЛЛФ борхлорина.101 Метод гомогенизацииНесмотря на положительные результаты, полученные в результатеисследования экструзии, в промышленных масштабах данный методнерентабелен. В этом случае используют гомогенизацию под высокимдавлением, которую проводят при температуре выше Тф.п. используемыхлипидов.Эффективность измельчения в гомогенизаторе зависит от множествафакторов, в том числе температуры, давления и количества циклов.Определяющими параметрами гомогенизации является размер липосом иуровень включения ЛВ.В ходе исследования измельчали 60 мл дисперсии МСЛ борхлоринапри величине давления 40 psig (280 кПа).Первоначально дисперсию борхлорина гомогенизировали по 10 сек,что соотвествует одному полному циклу гомогенизации дисперсии объемом60 мл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
