Диссертация (1141401), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Стерилизация липосом борхлоринаТак как ЛЛФ борхлорина предназначена для внутривенного введения кнейпредъявляетсятребованиестерильности.Длястерилизациилипосомальной дисперсии применяли метод фильтрации под давлением сиспользованием нейлоновых мембранных фильтров «Pall» с диаметром пор0,22 мкм, отвечающих требованиям ОФС.1.1.0016.15 «Стерилизация»(стерилизующая фильтрация). Профильтрованную дисперсию собирали встерильный стеклянный сборник.2.3.3. Лиофилизация ЛЛФ борхлоринаДля повышения стабильности и увеличения срока хранения ЛЛФборхлорина предложен метод сублимационной сушки.Основной задачей этапа лиофилизации ЛЛФ борхлорина являлисьвыбор режима лиофилизации и криопротектора, которые бы обеспечивалиполучение лиофилизата надлежащего качества, стабильного в течениедлительного срока хранения.Для определения эвтектической температуры борхлорина использовалитермический способ, в основе которого лежит фиксирование температурыобразца, замороженного ниже эвтектической точки, в процессе медленногооттаивания.Методика лиофилизации ЛЛФ борхлоринаВ липосомальную дисперсию борхлорина после экструзии вводилинеобходимый объем стерильного раствора криопротектора определенной76концентрации, перемешивали и проводили стерилизующую фильтрациючерез нейлоновые мембранные фильтры «Pall» с размером пор 0,22 мкм.Полученную стерильную дисперсию борхлорина разливали во флаконы по 4мл и лиофилизировали в камере сублимационной сушки.2.3.4.
Методы анализа ЛЛФ и ЛЛФ-лио борхлоринаКачественныйхроматографическийанализЛЛФиЛЛФ-лиоборхлоринаСовременная тонкослойная хроматография (ТСХ) является одним изведущих методов анализа в фармацевтических исследованиях, в том числепри установлении подлинности препаратов, определении количественногосодержания действующих активных компонентов, посторонних нелетучихпримесей и др. ТСХ заняла особое место среди других хроматографическихметодов благодаря простоте методики и доступности оборудования, широкойобластиприменения,селективности.Ввысокойвидувсеэкономичности,возрастающейдостаточновысокойинструментализациииавтоматизации ТСХ причисляют к наиболее чувствительным методаманализа [12, 16, 35].Для установления подлинности компонентов разработанной ЛФборхлорина применяли метод ТСХ.
Методика ТСХ-анализа ЛЛФ и ЛЛФ-лиоборхлорина представлена в разделах 4.1.1 и 4.1.4.Количественный спектрофотометрический анализ борхлорина в ЛЛФ иЛЛФ-лиоСпектроскопия в УФ- и видимой областях спектра входит в числостандартныхисследованияхметодов,науспешнопротяженииприменяемыхмногихвдесятилетий.аналитическихСпомощьюспектроскопии можно получать как качественные, так и количественныерезультаты [11].Применение спектрофотометрии в УФ- и видимой областях спектраосновано на поглощении электромагнитного излучения соединениями,77содержащимихромоформныеиндивидуальноевеществоиауксохромныепо-своемуреагируетгруппы.наКаждоеэлектронное,колебательное или вращательное возбуждение, формируя характерныйтолько для него спектр поглощения. Поэтому спектр поглощения, то естьграфическая запись процесса поглощения излучения относительно длиныволны или, соответственно, частоты света, дает информацию касательнотого, о каком именно веществе идет речь.
В случае смеси веществ получаютсуммарный спектр на основе всех содержащихся в этой смеси компонентов[11, 87].Количественноесодержаниепрепаратаопределялиметодомспектрофотометрии с использованием стандартного образца (СО) при длиневолны (662±2) нм на спектрофотометре Cary 100. Оптическую плотностьспиртовыхрастворовлипосомальногоборхлоринаиСОизмерялиотносительно спирта 95%. Методика количественного анализа борхлоринапредставлена в разделе 4.2.5.Валидация методики спектрофотометрического анализа борхлоринаДля того чтобы аналитическая методика заняла достойное место всистеме обеспечения качества, соответствовала своему назначению, то естьгарантировала достоверные и точные результаты анализа, предусмотренапроцедура ее валидации [18].Валидацию методики спектрофотометрического анализа борхлоринапроводили по следующим характеристикам: специфичность, диапазонприменения,линейность,правильность(точность),сходимость(повторяемость), внутрилабораторная (промежуточная) прецизионность,устойчивость (робастность).
Валидацию методики проводили в соответствиис ОФС.1.1.0012.15 «Валидация аналитических методик» [28], «Типовымруководствомпредприятияпопроизводствулекарственныхсредств.Валидация аналитических методик для производителей лекарств» подредакцией В.В. Береговых [18] и «Руководством для предприятий78фармацевтическойпромышленности.Методическиерекомендацииповалидации методик анализа лекарственных средств» под редакцией Н.В.Юргеля [86].Определение эффективности включения борхлорина в липосомыБорхлоринявляетсягидрофобнымвеществомивключаетсянепосредственно в липидный бислой.
Отделение не включенного в липосомывещества проводили путем фильтрации через нейлоновый мембранныйфильтр с диаметром пор 0,22 мкм. ЭВ определяли как отношениеконцентрации борхлорина в липосомальной дисперсии после фильтрации(Сфил) к концентрации борхлорина в липосомальной дисперсии послеполучения (Спол), выраженное в процентах:ЭВ (%)=Сфил/Спол×100%.Определение рН липосомальной дисперсии борхлоринаОпределениерНосуществлялиметодомпотенциометриисиспользованием рН-метра HANNA рН 211.Методика определения значения рН ЛЛФ и ЛЛФ-лио борхлоринаВ липосомальной дисперсии значение рН измеряют, не разбавляя. Дляопределения значения рН лиофилизата к нему добавляют 10 мл воды,перемешивают до получения однородной липосомальной дисперсии иизмеряют значение.
Предварительно измеряют значение рН воды. Измеренияпроводят в интервале температур от 20 до 25°С.Определение диаметра липосом борхлоринаАнализ среднего диаметра липосом и стандартное отклонение ихраспределенияпроводилиметодомдинамическогосветорассеяниясприменением фотонного корреляционного анализатора Submicron ParticleSizer NICOMP 380.Математическая обработка и интерпретация измеряемых показателейосуществляется программным обеспечением устройства на ПЭВМ. На экраненаблюдают кривую распределения липосом по размерам частиц.
Программа79позволяет оценивать результат с помощью Гауссовского анализа иНикомповского анализа (Рисунок 15).Рисунок 15. Представление результатов оценки распределения липосом борхлорина поразмеру программным обеспечением фотонного корреляционного анализатора SubmicronParticle Sizer NICOMP 380Гауссовский анализ представляет собой обработку полученных данныхметодом наименьших квадратов (анализ по двум параметрам) и Гауссовыпопуляции имеют четко определяемый средний диаметр частиц.
Однако этотподходможетиспользоватьсятолькодляпростыхраспределений:симметричных унимодальных популяций. Ассиметричные унимодальные ибимодальные распределения невозможно интерпретировать с помощьюГауссова анализа. Единственным признаком наличия более сложногораспределения является высокое и растущее значение квадратичногоотклонения. Эти распределения оценивают с помощью Никомповскогоанализа. Никомповский анализ дает в результате 3 или 4 параметра, по80которым можно судить о распределении в образце (показывает какогодиаметра и сколько (в %) в данной пробе содержится липосом).
Поэтому дляиллюстрации результатов анализа распределения липосом борхлорина поразмерамвдиссертационнойработеиспользовантолькофрагментНикомповского распределения (Nicomp distribution).Методика определения размера липосом борхлоринаАвтоматической пипеткой отмеривают 100 мкл исследуемого образцасвежеприготовленныхлипосомилиЛЛФ-лиоборхлоринапослерегидратации водой (спустя 10 мин после регидратации), помещают вмерную колбу вместимостью 100 мл и доводят водой до метки. Разведенныйобразец переносят в стеклянную кювету, которую помещают в ячейкуанализатора и проводят измерение.Определение формы липосом с помощью электронной микроскопии(негативное контрастирование)Наколлодиево-угольнуюпленку-подложкунаносилиобразец,контрастировали 1% раствором уранил ацетата и просматривали вэлектронном микроскопе JEM-100CX (JEOL, Япония) при увеличении в20000 раз с разрешением при сканировании 1200 dpi.
Для точного подсчетаувеличения использовали фото частиц латекса, имеющих средний диаметр109±3 нм.Методика определения потери в массе при высушиванииТочную навеску препарата (0,5 г) помещают в предварительновысушенный и взвешенный бюкс и сушат до постоянной массы в вакуумномсушильном шкафу над пятиокисью фосфора при комнатной температуре иостаточном давлении 5 мм рт.ст.2.3.5. Статистическая обработка данныхСтатистическую обработку полученных в ходе эксперимента данныхпроводили в программах Excel, Origin 6.1, руководствуясь ОФС.1.1.0013.15«Статистическая обработка результатов химического эксперимента» [28].81РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙГлава 3.
Разработка состава и технологии получения ЛЛФ-лиоборхлорина3.1. Разработка состава ЛЛФ борхлоринаВыбор компонентов для получения стерически стабилизированнойЛЛФ борхлорина основан на их функциональности. В качестве основногокомпонента,формирующегонатуральныйФЛяичный–биосовместимостью илипосомальнуюмембрану,фосфатидилхолин,вприменялисвязиприемлемыми физико-химическимисегосвойствами(температура фазового перехода около 37°С). Для придания бислоюнеобходимого уровня жесткости и механической устойчивости в состав ЛФвводили холестерин.
Молекула холестерина, взаимодействуя с двумямолекулами ФЛ, предотвращает их фазовый переход и способствует их болееплотной упаковке в бислое [62, 110]. Для стерической стабилизации липосомборхлоринадобавлялифосфатидилэтаноламин,конъюгированныйсгидрофильным полимером – ПЭГ. Согласно данным научных публикаций[62, 148] пэгилирование придает липосомальным препаратам большуюфизическуюитермическуюстабильностьипредотвращает/снижаетагрегацию везикул в организме или во время хранения, что являетсярезультатом стерической изоляции и/или маскирования зарядов.Поскольку борхлорин является гидрофобным веществом и включаетсянепосредственно в липидный бислой (Рисунок 16), эффективность егоинкапсуляции в липосомы напрямую зависит от концентрации липидов.Поэтому для достижения максимального уровня включения исследуемоговеществавлипосомы,необходимобылоопределитьоптимальноесодержание липидных составляющих ЛФ.Длярешенияпоставленнойзадачиполучалииисследовалиэкспериментальные модели ЛЛФ борхлорина с различными молярнымисоотношениями компонентов прописи.
Для приготовления липосомальной82дисперсиипокаждомуисследуемомусоставуиспользовалиметодгидратации липидной пленки, которую получали путем упариванияхлороформного раствора компонентов ЛФ. Липидную пленку гидратироваливодой для инъекций с образованием дисперсии МЛВ с концентрациейборхлорина 0,3 мг/мл, которую затем экструдировали с использованиемэкструдера, последовательно пропуская через нейлоновые мембранныефильтры «Pall» с размером пор 1,2 мкм (1 раз), 0,45 мкм (1 раз) и 0,22 мкм (4раза).Рисунок 16. Схематическое изображение липосомы борхлоринаКаждый модельный состав оценивали по таким показателям какуровень включения борхлорина в липосомы (ЭВ, %), средний размер везикули их устойчивость при хранении, значение рН и внешний вид липосомальнойдисперсии, а также технологическим параметрам – продолжительностьгидратации липидной пленки и экструзии дисперсии. Определяющимикритериями при выборе состава являлись данные по ЭВ и размеру везикулпосле экструзии (4-кратная экструзия через нейлоновый мембранный фильтрс диаметром пор 0,22 мкм) (Таблица 1).Таблица 1Модели составов ЛЛФ борхлорина№Молярные соотношенияборхлорин/ФХФХ/холестерин/ПЭГ-ДГФА1:0:0,0031:0,1:0,0031:0,25:0,0031:0,33:0,0031:0,50:0,0031:0,33:0,003121:10034561:140781:17091:1801011121:1851314151:190161:195171:200181:205191:210Примечание: * одна фракция (100%)1:0,33:0,0041:0,25:0,0041:0,33:0,0021:0,33:0,0041:0,33:0,0051:0,33:0,0061:0,33:0,004ЭВ, %88,0±1,090,0±1,089,0±0,892,0±0,691,0±0,893,0±1,093,0±1,096,0±0,597,0±0,696,0±1,098,0±0,898,0±0,597,0±1,196,0±1,093,0±1,091,0±1,499,0±0,599,0±1,099,0±0,5Размер липосом, нм(распределение по фракциям, %)после полученияпосле экструзии479±15 (98%)/17±10 (2%)186±8 (97%)/51±7 (3%)402±14 (99%)/11±4 (1%)190±10 (98%)/47±5 (2%)371±18 (98%)/17±8 (2%)205±6*261±14 (99%)/11±4 (1%)208±8*290±16*235 (97%)±12/18±6 (3%)556±22 (99%)/11±8 (1%)206±6 (99%)/15±3 (1%)238±22*196±8*656±20 (94%)/60±9 (6%)211±8*435±20 (98%)/27±8 (2%)198±9 (99%)/23±4 (1%)297±15 (99%)/11±5 (1%)190±8*294±18 (99%)/11±3 (1%)203±10 (98%)/28±3 (2%)230±14 (98%)/11±4 (2%)196±8 (99%)/11±3 (1%)235±18 (93%)/77±8 (7%)195±8*262±23*184±8*578±24 (97%)/28±11 (3%)207±10*543±18 (99%)/25±10 (1%)196±11*266±16 (99%)/11±6 (1%)185±8*310±15 (99%)/12±6 (1%)194±10*475±18 (97%)/29±7 (3%)205±8*84Поскольку холестерин играет важную роль в физической стабилизациилипидного бислоя на первоначальном этапе экспериментальной работы длявыбора оптимального соотношения ФХ/холестерин в липосомах борхлоринаоценивали влияние различной концентрации данного вспомогательногокомпонента в бислое на качество ЛФ.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
