Диссертация (1141401), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Классификация липосомВ зависимости от размера везикул и числа образующих их липидныхслоев (ламелл) выделяют следующие классы липосом (Рисунок 14):• многослойные или мультиламеллярные везикулы (МЛВ). Они состоятиз нескольких десятков, а то и сотен липидных бислоев, разделенныхводными промежутками, и имеют довольно крупные размеры – от 500нм до 50 мкм.• олиголамеллярные везикулы (ОЛВ) в отличие от многослойныхсостоят из 2-4 бислоев с диаметром от 100 до 1000 нм.• однослойные или моноламеллярные везикулы, которые образованыодним липидным бислоем.
Данные везикулы подразделяются на малые(20-100 нм) и большие (100-1000 нм) (ММВ и БМВ соответственно).• олиговезикулярные (ОВЛ) и мультивезикулярные липосомы состоят изкрупной липосомы, внутри которой располагается несколько болеемелких.56Рисунок 14. Различные виды липосом [7]Липосомы не всегда внешне могут выглядеть как глобулы. Иногда онипринимают уплощенную дискообразную форму (так называемые дискомы)или имеют вид очень длинных и тонких трубок, которые называюттубулярными липосомами [7].Одноламеллярные везикулы обычно используют для доставки одногоЛВ. МЛВ могут применяться для транспортировки в опухоль двух и болеекомпонентов, а также для транспортировки макромолекул, таких как белки,пептиды и нуклеиновые кислоты (мультифункциональные липосомы) [70,142, 166].
Так в исследовании [57] была продемонстрирована высокаяцитотоксическая активность новых противоопухолевых препаратов –координационных комплексов европия, которые включались в МЛВ вкомбинации с визуализирующим агентом.Согласно исследованиям [31, 90] наиболее оптимальными для доставкихимиотерапевтических агентов являются липосомы с диаметром 100 – 200нм.Липосомы по своей структуре и функциям подразделяются наследующие типы: простые липосомы, стерически стабилизированные57липосомы, липосомы для направленного транспорта, катионные липосомы,липосомы с эндогенными и экзогенными воздействиями.Простые (классические) липосомы состоят только из ФЛ или ФЛ ихолестерина. Введенные различными путями in vivo, они циркулируют вкровотоке в течение довольно короткого периода времени и быстронакапливаютсявретикулоэндотелиальнойсистеме(РЭС).Большоеколичество фагоцитов и обильное кровоснабжение являются главнымипричинами захвата везикул преимущественно печенью и селезенкой.Благодаря этому свойству липосомы можно использовать для доставки вмакрофаги иммуномодуляторов, цитотоксических и противомикробныхсоединений, а также для диагностики, например, в качестве носителейрадиоизотопов и контрастных средств для визуализации.Стерически стабилизированные липосомы (Stealth-липосомы).
Дляпредотвращения опсонизации и поглощения липосом клетками РЭС ихповерхностьмодифицируютгидрофильнымиполимерами(полиэтиленгликоль (ПЭГ) 2000, 5000 и др.), которые формируют защитныйслой и препятствуют распознаванию везикул белками плазмы. В результатеотмечаетсязначительноепродолжительностиснижениециркуляцииклиренсалипосомвиувеличениекрови,обеспечиваяпролонгированный терапевтический эффект ЛВ [152]. Кроме ПЭГ длястабилизации липосом в кровотоке используют фосфатидилинозит. Остаткимиоинозита молекул фосфатидилинозита создают на поверхности мембранывысокогидратированную стерически стабилизированную оболочку, подобноостаткам ПЭГ [21, 71].Уникальной особенностью липосом является возможность доставкихимиотерапевтическихагентоввнутрьопухолевойклеткисцельюповышения эффективности и селективности их действия. Направленныйтранспорт осуществляется за счет присоединения векторных молекул(лигандов) к поверхности липосом.
Лиганды способствуют селективному58связыванию с опухоль-ассоциированными антигенами или рецепторами,расположенными на поверхности опухолевых клеток. В качестве векторныхмолекул могут выступать МКА или их фрагменты (Fab-фрагменты МКА),пептиды, факторы роста и другие специфические лиганды.
Липосомы, кповерхности которых присоединены МКА или Fab-фрагменты МКА,называютсяиммунолипосомами.Иммунолипосомыявляютсявесьмаперспективным средством доставки противоопухолевых ЛВ. При выбореантитела для конструирования иммунолипосом следует учитывать рядфакторов: МКА должно сохранять свою специфичность при конъюгированиис липосомами, обладать высокой аффинностью к клетке-мишени и низкойиммуногенностью [97, 153].Одним из подходов по улучшению доставки терапевтических агентовявляется использование лизосомо-направленных липосом. Суть данногоподхода заключается в том, что, попав в клетку, подобная липосомасвязываетсяслизосомойпосредствомспецифическоголигандаипоглощается ею. Внутри лизосомы под действием ферментов происходитразрушение липидного бислоя с последующим высвобождением ЛВ, котороеоказывает необходимое терапевтическое воздействие.
В исследовании [149]изучалась эффективность новых лизосомотропных лигандов на основенейтрального красного и родамина В посредством их прикрепления кповерхностилипосом,которыесодержалимодельноесоединение,обладающее флюоресцентными свойствами. С помощью конфокальноймикроскопии было доказано, что уровень доставки модельного соединенияпосредством модифицированных липосом, значительно выше по сравнениюс простыми липосомами [155].Липосомы также активно изучаются в качестве потенциальных средствнаправленной доставки генов в определенные участки тела. Для доставкигенетическогоматериалаиспользуюткатионныелипосомы,которыевзаимодействуют с отрицательно заряженной молекулой ДНК, нейтрализуют59ее и сжимают в более компактную структуру, обеспечивая при этом защитуот нуклеаз, клеточную интернализацию путем эндоцитоза и экспрессиюсжатой плазмиды.
Известно, что важнейшим этапом процессинга виросомявляется слияние ее мембраны с мембраной эндосомы, происходящее поддействием гемагглютинина. При этом содержимое липосомы попадает вцитозоль, то есть избегает лизосомальных ферментов. Именно этот путьсчитается предпочтительным для липосом, нагруженных генетическимматериалом [53, 107].В последние годы большой интерес представляют исследования вобласти применения липосомальных препаратов в сочетании с различнымиэндогенными (пониженное значение рН [134, 169], наличие специфическихферментов [168, 178]) и экзогенными воздействиями (свет [133, 143],ультразвук [176], нагрев [66, 173], а также их сочетания [141]), что позволяетувеличить избирательность доставки ЛВ к опухоли и контролировать еговысвобождение внутри нее.
В основе механизма действия подобных системдоставкилежитответнаяреакциянатриггерноевоздействие,способствующее разрушению структуры липосомальной мембраны (еедеструкции),врезультатечегопроисходитвысвобождениеинкапсулированного ЛВ из липосомы в поврежденную ткань/опухолевуюткань. Контролируемое высвобождение особенно важно при химиотерапиибыстропрогрессирующихопухолей,вкоторыхнеобходимонезамедлительное создание высоких концентраций ЛВ для получениястойкого цитотоксического эффекта [139].1.2.5.
Методы получения липосомСущественным образом на свойства липосом влияют методы ихполучения. От технологии приготовления зависит размер везикул, степеньокисления липидов, входящих в состав оболочки, их внутренний объем,стабильность при хранении и другие характеристики. Известны различныеспособы получения липосом, каждый из которых имеет свои преимущества и60недостатки, поэтому выбор метода, в основном зависит от задач,поставленных при разработке той или иной ЛЛФ.Вбольшинствеслучаевполучениелипосомначинаетсясприготовления МЛВ по классической методике Бенгхема (пленочныйметод, гидратация липидной пленки).
Это наиболее широко используемый ипростой метод получения МЛВ в лабораторных и полупромышленныхмасштабах. В основе данного метода лежит упаривание раствора липидов дополучения тонкой пленки на дне круглодонной колбы с последующей еесушкой для удаления остаточного растворителя. Полученную пленку затемгидратируют с образованием липосомальной дисперсии.
Гидратациюпроводят при температуре выше температуры фазового перехода (Тф.п.)липидов, либо выше Тф.п. самого высокоплавящегося компонента в липиднойсмеси. Вещества для инкапсулирования в зависимости от их растворимостидобавляют в растворитель для гидратации (гидрофильные) или растворяют слипидами в органическом растворителе (гидрофобные и жирорастворимые).Недостатками метода является образование гетерогенных по размеру везикулс небольшим внутренним объемом и низкой ЭВ гидрофильных веществ[162].Разработаны методы получения липосом, основанные на сменерастворителя и имеющие множество модификаций: инжекция растворителя,детергентный диализ, обращение фаз.Метод инжекции – получение липосом посредством впрыскиванияраствора ФЛ в органическом растворителе (диэтиловый эфир, смесьэфир/метанол,этанол)вводнуюсреду.Последующееудалениеорганического растворителя под вакуумом приводит к образованию липосом.В условиях метода можно контролировать размер формируемых липосомпутем регулирования температуры водной среды, природы растворителя дляФЛ, концентрации ФЛ и скорости перемешивания.
Недостатками метода61являются низкая ЭВ вещества в липосомы, нестандартность и низкаястабильность получаемых липосом [49].Метод удаления детергента (детергентный диализ). Детергенты вкритическойконцентрациимицеллообразованияиспользуютсядлясолюбилизации липидов. В процессе удаления детергента путем диализа ФЛобъединяются в везикулы гетерогенные по размеру. Метод отличаетсяхорошей воспроизводимостью [162].Метод обращения фаз. Метод обеспечивает максимальное включениеводной фазы в структуру липидных везикул.
Данный метод имеет ряд идругих преимуществ: он технологичен и дает возможность включать влипосомы как гидрофильные, так и гидрофобные соединения; ЭВ вовнутреннюю оболочку гидрофильных веществ достигает уровня 80%;позволяетмаксимальноизбежатьзагрязнениялипосомпостороннеймикрофлорой в процессе получения, за счет использования хлороформа,являющегосяхорошимдезинфицирующимсредством.Методдаетвозможность частичной автоматизации технологического процесса [54].Однослойные липосомы получают в основном путем разрушения МЛВразличными способами: обработкой УЗ, экструзией с использованием прессаФренча или фильтрующих мембран, гомогенизацией/микрофлюидизацией,методом «замораживание-оттаивание» и др.УЗ обработка.
Метод представляет собой обработку МЛВ пульсирующимизвуковыми волнами высокой частоты, в результате которой происходитразрыввезикулсобразованиемдисперсииоднослойныхлипосом.Озвучивание дисперсии липосом может производиться двумя способами: всоникаторе банного типа или с использованием зондирующего соникаторапутем непосредственного погружения наконечника зонда в липосомальнуюдисперсию [110].Полученные таким способом липосомы недостаточно устойчивы прихранении, что требует введения стабилизирующих веществ, и отличаются62неоднородностью состава [47, 49]. Кроме того, в процессе озвучиванияпроисходитинтенсивноенагреваниелипосомальнойдисперсии,чтоприводит к окислению и гидролизу ФЛ [89].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
