Диссертация (1141401), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Были проанализированы модельныесоставы с молярными соотношениями ФХ/холестерин 1:0 (состав 1); 1:0,1(состав 2); 1:0,25 (состав 3); 1:0,33 (состав 4) и 1:0,5 (состав 5) присоотношениях борхлорин/ФХ 1:100 и ФХ/ПЭГ-ДГФА 1:0,003 (Таблица 1).Врезультатепроведенныхтехнологическихисследованийустановлено, что ЭВ борхлорина в липосомы не имела прямой зависимостиот количества холестерина в бислое и наибольший уровень инкапсуляцииборхлорина – 92% отмечался при соотношении ФХ/холестерин 1:0,33 (состав4).В то же время с увеличением доли холестерина в липосомальноймембране наблюдался постепенный рост везикул в диаметре после экструзии,что вероятно обусловлено повышением уровня жесткости бислоя и егомеханической устойчивости при измельчении липосом.Наименьший размер после экструзии 186 нм имели липосомы, несодержащие холестерин (состав 1), а при введении холестерина в состав ЛФв соотношении ФХ/холестерин 1:0,1 (состав 2) отмечалось незначительноеукрупнение везикул до 190 нм (Рисунок 17А, 17Б).
Однако в обоих случаяхлипосомы оказались склонны к слиянию и при хранении увеличивались вразмерах.85АБРисунок 17. Распределение везикул по размеру после экструзии:А – состав 1 – фракции липосом со средним диаметром 186 и 51 нм,Б – состав 2 – фракции липосом со средним диаметром 190 и 47 нмПри использовании составов 3 и 4 формировались устойчивые прихранении и однородные по размеру липосомы с близкими значениями – 205 и208 нм соответственно (Рисунок 18А, 18Б).АБРисунок 18.
Средний размер везикул после экструзии:А – состав 3 – 205 нм, Б – состав 4 – 208 нмВ случае состава 5 отмечалось образование гетерогенных везикул сосредним диаметром преобладающей фракции (99%) 235 нм (Рисунок 19).86Рисунок 19. Распределение везикул по размеру после экструзии для состава 5 –фракции липосом со средним диаметром 235 и 18 нмКроме того, в ходе эксперимента было замечено, что концентрацияхолестерина в ЛФ существенно влияет и на технологический процессполучения липосомальной дисперсии. При упаривании хлороформногораствора компонентов ЛФ, не содержащего холестерин (состав 1) илисодержащего его в низкой концентрации (состав 2) на стенках круглодоннойколбы образовывалась неравномерная липидная пленка в виде размытыхкапель (Рисунок 20А).
В процессе гидратации полученной пленкиформировалась очень пенистая липосомальная дисперсия. При болеевысоком содержании холестерина (составы 3-5) формировалась равномернаяпленка, которая легко гидратировалась с небольшим объемом пены (Рисунок20Б).АБРисунок 20. Внешний вид липидной пленки:А – составы 1 и 2, Б – составы 3 – 587Исходя из вышеизложенного, для продолжения исследования вкачестве рабочего было выбрано соотношение ФХ/холестерин 1:0,33.Поскольку ФХ является основным формирующим компонентом бислоялипосом, ответственным за связывание борхлорина, на следующем этапеработы увеличивали его содержание в ЛФ относительно данного ФС домаксимально возможного уровня включения. При этом общая масса липидовповышалась также за счет пропорционального увеличения холестерина иПЭГ-ДГФА.Первоначальное соотношение борхлорин/ФХ 1:100 было увеличено до1:140 (состав 6).
В результате отмечалось образование гетерогенных липосомсо средним диаметром везикул преобладающей фракции (99%) 206 нм(Рисунок 21А) и незначительно увеличившимся включением борхлорина до93% (Таблица 1). Повышение концентрации ПЭГ-ДГФА в прописи досоотношения ФХ/ПЭГ-ДГФА 1:0,004 (состав 7) способствовало получениюгомогенной дисперсии после экструзии без изменения уровня инкапсуляцииборхлорина (Рисунок 21Б).АБРисунок 21. Распределение везикул по размеру после экструзии:А – состав 6 – фракции липосом со средним диаметром 206 и 15 нм,Б – состав 4 – фракция липосом со средним диаметром 196 нмДалее постепенно повышая содержание ФЛ и используя соотношениелипидов 1:0,33:0,004, получили состав 12 с молярным соотношениемборхлорин/ФХ 1:185, в котором ЭВ достигла достаточно высокого значения88– 98%.
Однако при использовании данного состава формировалисьнеоднородные везикулы с диаметром по фракциям 196 (99%) и 11 (1%) нм,склонные к слиянию и укрупнению в процессе хранения. При замененейлоновых фильтров на поликарбонатные при экструзии дисперсииситуация не улучшилась: полученные везикулы диаметром около 170 нмчерез сутки укрупнялись практически в 2 раза. Поэтому для получения болеестабильных липосом с данной концентрацией ФХ исследовали различныесочетания ФХ/холестерин/ПЭГ-ДГФА в составах 10, 11, 13, 14 (Таблица 1).По результатам проведенного исследования установлено, что в составе 10при снижении концентрации холестерина в липосомальной мембране до 20%мол.
образуется гомогенная дисперсия со средним размером липосом 190 нм,однако ЭВ снижается до 97%, что возможно связано с частичнойдестабилизацией бислоя. Более низкое содержание ПЭГ-ДГФА в составе 11способствовало укрупнению везикул обеих фракций до 203 (98%) и 28 (2%)нм. При увеличении ПЭГ-ДГФА в составах 13 и 14 одновременно сполучением более устойчивых и однородных липосом наблюдалосьснижение уровня инкапсуляции борхлорина соответственно до 97 и 96%, чтовероятно обусловлено встраиванием пэгилированного липида в возможныеучастки связывания ФС в бислое. Кроме того, высокое содержание ПЭГДГФА в составе ЛФ привело к затруднениям при получении дисперсииМСЛ.Приупариваниихлороформныйрастворкомпонентовплохо«сцеплялся» со стенками колбы и стекал на дно сосуда.
В результате наколбе формировалась неравномерная пленка, которая гидратироваласьдлительное время с образованием плотной массы. Таким образом, составы10-14смолярнымсоотношениемборхлорин/ФХ1:185далеенеисследовались.С целью установления более пригодного состава продолжалиэкспериментальную работу, увеличивая концентрацию ФЛ. В результате былполучен оптимальный состав 17 с молярным соотношением борхлорин/ФХ891:200, который обеспечивал наибольшую эффективность инкапсуляцииборхлорина в липосомы – на уровне 99% и средний размер везикул послеэкструзии – 185 нм (Рисунок 22).Рисунок 22. Средний размер везикул после экструзии для состава 17 – 185 нмПри дальнейшем увеличении доли ФХ в составе ЛФ (пропись 18 и 19)ЭВ борхлорина сохранялась на уровне 99%. Однако дополнительноевведение ФХ приводило к образованию более крупных липосом, чтовозможно обусловлено образованием более вязких дисперсий, что затрудняетпроцесс экструзии.
Для состава 18 средний размер везикул составил 194 нм(Рисунок 23А), для состава 19 – 205 нм (Рисунок 23Б).АБРисунок 23. Средний размер везикул после экструзии:А – состав 18 – 194 нм, Б – состав 19 – 205 нмВ ходе работы значения рН липосомальной дисперсии находились впределах 5,4-7,5. При изучении зависимости рН дисперсии от компонентов90ЛФ и применяемых растворителей в процессе приготовления липосом былоустановлено, что колебания показателя кислотности среды обусловленытолько переменчивостью значений рН воды для инъекций, используемой длягидратации липидной пленки.На основании данных экспериментальной работы из наработанныхмоделей ЛЛФ был выбран состав 17 с молярными соотношениямиборхлорин/ФХ 1:200 и ФХ/холестерин/ПЭГ-ДГФА 1:0,33:0,004, которыйобеспечивает максимальный уровень включения борхлорина 99% иполучение однородных липосом размером 185±8 нм.3.2.
Разработка технологии получения ЛЛФ-лио борхлоринаПроцесспоследовательноеполучениялипосомальногопрохождениеследующихборхлоринавключаеттехнологическихэтапов:получение тонкой липидной пленки из органического раствора компонентовЛЛФ, формирование МСЛ путем гидратации пленки, получение дисперсииОСЛ приемлемого размера (100-200 нм), стерилизующая фильтрациялипосомальной дисперсии и ее лиофилизация.3.2.1. Получение липидной пленкиНаиболеепростымметодомполучениялипосомвусловияхлаборатории является гидратация липидной пленки.Отвешивали ФХ, холестерин и ПЭГ-ДГФА в соответствии свыбранным составом 17 (Таблица 2) и растворяли в 15-20 мл хлороформа. Кточной навеске борхлорина добавляли 10 мл хлороформа и обрабатывали УЗв течение 10-15 мин для ускорения процесса растворения.
Полученныехлороформные растворы компонентов ЛФ смешивали и количественнопереносили в круглодонную колбу вместимостью 2 л.91Таблица 2Состав хлороформного раствора компонентов ЛЛФ борхлоринаБорхлоринФХХолестеринПЭГ-ДГФАХлороформКомпонент ЛФМасса/объем компонента10 мг1760 мг309 мг30 мг25-30 млХлороформ отгоняли под вакуумом (-0,8 бар) при температуре вышеТф.п. фосфолипида 37±1°С до получения полупрозрачной липидной пленки. Впроцессе работы отмечали, что равномерность распределения по стенкамколбы липидной пленки и скорость отгона хлороформа из органическогораствора компонентов ЛФ напрямую зависит от скорости вращения ротора.Установлено, что при небольшой скорости вращения от 30 до 60 оборотов вминуту (об/мин) раствор постепенно «сползает» со стенок колбы иконцентрируется в области дна сосуда с образованием в течение довольнодлительного периода времени толстой неравномерной пленки.
Повышениюскорости отгона хлороформа и формированию более равномерной пленкиспособствует увеличение первоначальной скорости вращения колбы до 90120 об/мин с ее постепенным снижением до минимально возможногозначения (30 об/мин) по мере удаления растворителя и сгущения растворакомпонентов ЛФ. Увеличение скорости вращения ротора более 120 об/мин,хотя и способствует большей скорости удаления хлороформа, приводит кобразованию неравномерной липидной пленки по боковой части колбы вформе «ободка».
Таким образом, наиболее приемлемой является скоростьвращения колбы 90-120 об/мин, которая обеспечивает равномерноераспределение пленки на стенках колбы и достаточную скорость отгонахлороформа из раствора компонентов ЛФ.После формирования липидной пленки ее досушивали под вакуумом(-0,9 бар) в течение 50 мин до полного удаления остатков органическогорастворителя. Полученную липидную пленку гидратировали растворителем с92образованием дисперсии МСЛ, которую помещали в холодильник (+2...+8ºС)для отстаивания пены.3.2.2. Выбор дисперсионной среды для гидратации липидной пленкиПри выборе гидратирующей жидкости для получения липосомальнойдисперсии борхлорина сравнивали следующие растворители: воду дляинъекций, 5% раствор глюкозы и изотонический раствор натрия хлорида.Результаты исследования представлены в Таблице 3.Выбор растворителя для гидратации липидной пленки№РастворительРазмер липосом, нм(распределение по фракциям, %)после полученияпосле экструзии266±16 (99%)/11±6 (1%)185±8*259±15 (98%)/29±10 (2%)195±7*Вода для инъекций5% раствор глюкозыИзотонический раствор3404±23 (99%)/11±8 (1%)натрия хлоридаПримечание: * одна фракция (100%)12Таблица 3206±8*ЭВ, %99,0±0,595,0±0,893,0±0,7Полученные результаты показали, что вода для инъекций в качестведисперсионной среды обеспечивает получение дисперсии с оптимальнымипараметрами качества: ЭВ борхлорина достигала уровня 99% и диаметрвезикул после экструзии составил 185 нм.Дисперсия,полученнаяпригидратациилипиднойпленки5%раствором глюкозы, медленно экструдировалась (скорость экструзии – 1 млдисперсии/мин) с образованием липосом со средним диаметром 195 нм.Получение в процессе измельчения более крупных везикул вероятнообусловлено связыванием глюкозы с ФЛ бислоя и его стабилизацией.
Крометого, отмечалось снижение уровня инкапсуляции борхлорина в везикулы до95%.Процесс гидратации пленки изотоническим раствором натрия хлоридапротекал с затруднениями, поскольку пленка смывалась длительное время собразованием гелеобразной массы с размером везикул более 400 нм.93Экструзия позволила уменьшить диаметр в 2 раза – до 206 нм. При этом ЭВборхлорина составила 93%.Таким образом, вода для инъекций выбрана в качестве растворителядля получения дисперсии МСЛ борхлорина.3.2.3. Получение однослойных липосом борхлоринаНаэтапегидратациитонкойлипиднойпленкиобразуютсянеоднородные везикулы со средним диаметром преобладающей фракцииоколо 270 нм.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
