Диссертация (1141401), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Технологическая схема получения ЛЛФ-лио борхлорина118Для проведения комплекса доклинических исследований с цельюоценки безопасности и эффективности применения разработанной ЛФэкспериментальныесериипрепарата«Борхлоринлипосомальный,лиофилизат для приготовления дисперсии для инъекций 1,0 мг» былипереданы в МГУ им. М.В. Ломоносова, Лабораторию фармакологии итоксикологии НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» МинздраваРоссии, Лабораторию экспериментальной и фотодинамической терапииФГБУ «Медицинский радиологический научный центр» МЗ РФ.
Результатыисследований представлены в Приложениях 2-5.ЗАКЛЮЧЕНИЕВ результате проведенных исследований предложен оптимальныйсостав и разработана технология получения стерически стабилизированнойЛЛФ борхлорина, предназначенная для внутривенного введения.Из 19 наработанных моделей ЛЛФ выбран состав с молярнымисоотношениями компонентов борхлорин/ФХ 1:200 и ФХ/холестерин/ПЭГДГФА 1:0,33:0,004, который обеспечивал получение везикул со среднимразмером 185±8 нм и включением препарата на уровне 99%.Для получения дисперсии МСЛ на стадии гидратации липидной пленкив качестве растворителя выбрана вода для инъекций, которая позволяетполучить ЛЛФ борхлорина надлежащего качества.С целью получения ОСЛ борхлорина приемлемого размера былиисследованы наиболее распространенные методы – экструзия под давлениемсиспользованиемфильтрующихмембран,обработкаУЗигомогенизация/микрофлюидизация.
В результате сравнительного анализаспособов получения липосом борхлорина установлено, что наиболееоптимальным методом является экструзия под давлением. Установлено, что5-кратное экструдирование с использованием нейлонового фильтра с119диаметром пор 0,22 мкм обеспечивает получение стабильной в процессехранения липосомальной дисперсии с приемлемым размером везикул ивысоким уровнем включения борхлорина в липосомы. Для получения ЛЛФборхлорина в промышленных масштабах может быть использован методгомогенизации.Дляувеличениясрокахраненияпредложенатехнологиясублимационной сушки ЛЛФ борхлорина: определен оптимальный режимлиофилизациилипосомальнойдисперсиииподобранэффективныйкриопротектор. При лиофилизации липосом борхлорина использован режимс быстрым снижением температуры на стадии замораживания. В качествекриопротектора выбрана сахароза в молярном соотношении ФХ/сахароза 1:5,котораяобеспечиваетстабильностьструктурылипосомвпроцесселиофилизации с сохранением размера везикул и высокого уровня включенияборхлорина.
Кроме того, установлено, что наиболее оптимальным считаетсявведение раствора криопротектора в готовую липосомальную дисперсиюборхлорина перед процессом сублимационной сушки.120Глава 4. Разработка методик контроля качества ЛЛФ и ЛЛФ-лиоборхлорина4.1.Разработкаметодикитонкослойнойхроматографиидлякачественного анализа ЛЛФ и ЛЛФ-лио борхлорина4.1.1. Методика ТСХ-анализа борхлорина и липидных компонентов ЛФПриготовление исследуемого образца ЛЛФ и ЛЛФ-лио борхлоринаК2млсвежеприготовленнойрегидратированнойЛЛФ-лиолипосомальнойборхлорина(кдисперсиисодержимомуилифлаконадобавляют 3,7 мл воды и перемешивают) прибавляют 3 мл спирта 95% иперемешивают. Концентрация борхлорина в полученном образце 0,1 мг/мл.Приготовление стандартных образцов веществ-свидетелей (СОВС)СОВС-1 – спиртовой раствор борхлорина 0,1 мг/мл.
Навеску борхлорина 1,0мг растворяют в 10 мл спирта 95% с использованием УЗ-ванны.СОВС-2 – спиртовой раствор ФХ 18 мг/мл. Навеску ФХ 180,0 мг растворяютв 10 мл спирта 95%.СОВС-3 – спиртовой раствор холестерина 3,2 мг/мл. Навеску холестерина32,0 мг растворяют в 10 мл спирта 95%.Подготовка хроматографической камерыПодвижную фазу готовят в отдельной емкости путем смешиваниявыбранных растворителей и переливают в камеру, выложив внутренниестенки фильтровальной бумагой, смоченной в элюенте. Плотно закрываюткамеру крышкой и оставляют на 25-30 мин для насыщения камеры парамиэлюента.Подготовка йодной камерыНа дно эксикатора устанавливают тигель, в который насыпаюткристаллы йода 1,0 г, оставляют на 10-15 мин для возгонки йода.Приготовление 20% серной кислотыК 100 мл воды осторожно при помешивании приливают 25 млконцентрированной серной кислоты.121Методика проведения анализаНа линию старта хроматографической пластинки наносят по 4 мклисследуемого образца ЛЛФ (или ЛЛФ-лио) борхлорина (содержаниеборхлорина в наносимой пробе 0,4 мкг) и спиртовых растворов СОВСборхлорина (СОВС-1 – 0,4 мкг), ФХ (СОВС-2 – 72,0 мкг) и холестерина(СОВС-3 – 12,8 мкг).После подсушивания на воздухе пластинку с нанесенными пробамипомещают в хроматографическую камеру с элюентом, плотно закрываюткрышкой и хроматографируют восходящим способом.
После достиженияфронтом элюента линии финиша (пробег 12 см) пластинку вынимают изкамеры и высушивают в потоке теплого воздуха до полного удаления запахарастворителя.Борхлорин идентифицируют на пластинке визуально по характернымзеленымпятнамбезиспользованияспецифическихреактивов.Дляобнаружения ФХ пластинку помещают в камеру, насыщенную парами йода,и выдерживают около 1 мин до появления ярко-желтых пятен ФХ.Совместно с ФХ проявляются светло-желтые быстро исчезающие пятнахолестерина.
Обнаружение холестерина проводят, опрыскивая пластинкуразведенной серной кислотой с последующим нагреванием в сушильномшкафу до появления характерных розово-фиолетовых пятен холестерина.ПЭГ-ДГФА не определяется в связи с его низкой концентрацией ванализируемых пробах (0,3 мг/мл).Проявившиеся пятна в липосомальных образцах идентифицируютотносительно пятен веществ-свидетелей и характеризуют по величинеудерживания Rf, рассчитываемой по формуле:Rf = Lв/Lф,где: Lв – расстояние от линии старта до центра хроматографической зоныисследуемого вещества, мм; Lф – расстояние от линии старта до линиифиниша элюента, мм [12].1224.1.2. Выбор подвижной фазы для ТСХ-анализа борхлорина и липидныхкомпонентов ЛФПоскольку значительное влияние на разделение веществ в тонком слоесорбента оказывает растворитель, основной задачей данного исследованияявлялся выбор подвижной фазы (системы растворителей), обеспечивающейэффективное разделение компонентов ЛФ борхлорина с последующей ихидентификацией.
Для получения подвижной фазы использовали следующиерастворители: аммиак водный 25%, ацетон, бутанол, вода, ледяная уксуснаякислота, метанол, пропанол, хлороформ, этанол 95%, этилацетат. Системырастворителей оценивали по величине удерживания Rf, и количествуобнаруживаемых зон (пятен) на пластинке. Кроме того, отмечали времяпробега подвижной фазы.На первоначальном этапе было изучено 16 типов элюирующих системразличного состава и полярности. Полярность подвижной фазы (элюента)рассчитывали по диэлектрической проницаемости входящих в его составрастворителей с учетом содержания каждого компонента по формуле:Е = Σ εiφi,где Е – значение диэлектрической проницаемости фазы с учетом содержаниякаждого растворителя; εi – диэлектрическая проницаемость растворителя; φi– объемная доля растворителя в системе [60].Как видно из полученных результатов, представленных в Таблице 16,на разделение хроматографических зон влияет не только полярностьрастворителя, но и качественный состав подвижной фазы, так как в системахсблизкимизначениямихроматографические картины.полярностинаблюдаютсяразличныеТаблица 16Выбор подвижной фазы для разделения борхлорина и липидных компонентов в составе ЛЛФ и ЛЛФ-лиоЗначение RfСистема№РастворителиСоотношениехлороформ/метанол9:1хлороформ/этанол20:1хлороформ/этанол10:1хлороформ/этанол/вода65:25:4хлороформ/ацетон/525:15:5:4ледяная уксусная кислота/вода6хлороформ/аммиак 25%4:17хлороформ/аммиак 25%19:1хлороформ/ацетон/этилацетат/815:10:10:3:3ледяная уксусная кислота/водаацетон/этилацетат/915:10:3:5ледяная уксусная кислота/водаацетон/этилацетат/103:2:1ледяная уксусная кислотапропанол/хлороформ/1127:23:3:1ледяная уксусная кислота/водапропанол/аммиак 25%/1215:15:3:5ледяная уксусная кислота/водапропанол/1312:3:1ледяная уксусная кислота/водабутанол/хлороформ/ацетон/1425:25:15:5:4ледяная уксусная кислота/вода15 бутанол/ледяная уксусная кислота/вода6:3:216 бутанол/ледяная уксусная кислота/вода12:3:5Примечание: Е – полярность подвижной фазы [60]1234ЕборхлоринФХхолестеринВремяпробега7,86,16,913,5ЛФ0,200,060,131,00СОВС-10,120,020,081,00ЛФ0,060,03старт0,09СОВС-20,040,01старт0,08ЛФ0,910,770,950,90СОВС-30,910,770,950,901ч 15´1ч 05´2ч 15´3ч 30´16,60,560,480,260,221,001,002ч7,45,70,080,080,060,02стартстартстартстарт0,690,610,670,611ч 20´1ч 10´14,80,230,170,040,040,970,972ч24,30,660,670,020,020,850,901ч 25´14,30,05старт0,030,030,780,7840´15,80,220,220,030,030,800,802ч 30´26,50,970,970,080,081,001,006ч 40´23,70,360,130,040,040,900,904ч16,70,360,340,140,070,840,892ч26,832,10,500,630,500,650,090,300,090,320,670,840,670,863ч 30´5ч 10´124При включении в состав подвижной фазы таких высокополярныхкомпонентов как метанол, этанол, ацетон и аммиак (системы 1-3, 6, 7, 10)значительно сокращалось время пробега элюента, однако снижаласьподвижность борхлорина и ФХ, и соответствующие им пятна нахроматограмме имели значения Rf менее 0,20, либо оставались на старте.
Приналичии в системах 11-16 пропанола и бутанола отмечалось значительноеувеличение времени пробега элюента и подвижности борхлорина. В системах4 и 12 пятна борхлорина и холестерина перемещались совместно с фронтомрастворителей, а пятно ФХ едва отходило от старта. В системах 5 и 16(Рисунок 37А, 37Б) наблюдалось хорошее разделение компонентов ЛФ,однако значение Rf для холестерина превысило 0,80. Время пробегаподвижной фазы 16 составило более 5 ч, что затрудняет проведение анализа.А в случае использования элюирующей системы 5 отмечено стойкоерасхождение в значениях Rf для борхлорина и ФХ в ЛФ и стандартныхрастворах. Поэтому данные системы непригодны для качественного анализаЛФ борхлорина.АБРисунок 37. Вид хроматограммы:А – система 5 (хлороформ/ацетон/ледяная уксусная кислота/вода (25:15:5:4)),Б – система 16 (бутанол/ледяная уксусная кислота/вода (12:3:5));1 – исследуемый образец ЛФ, 2 – СОВС-1, 3 – СОВС-2, 4 – СОВС-3125Система15(бутанол/ледянаяуксуснаякислота/вода(6:3:2))обеспечивала наилучшее разделение борхлорина (Rf=0,50) и холестерина(Rf=0,67) в течение 3,5 ч, в то время как пятно ФХ практически оставалось настарте (Рисунок 38А).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
