Диссертация (1141401), страница 21
Текст из файла (страница 21)
Методика спектрофотометрического определения борхлорина влиофилизатеК содержимому флакона ЛЛФ-лио борхлорина добавляют 3,7 мл водыи перемешивают до получения однородной липосомальной дисперсии.Полученнуюдисперсиюколичественнопереносятвмернуюколбувместимостью 25 мл, доводят спиртом 95% до метки и перемешивают(раствор А).
5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25мл, доводят спиртом до метки и перемешивают (раствор Б). Измеряютвеличину оптической плотности раствора Б в кюветах с толщинойоптического слоя 10 мм в максимуме поглощения относительно растворасравнения. Параллельно проводят измерение оптической плотности раствораСО субстанции борхлорина относительно раствора сравнения.Содержание борхлорина во флаконе (Х, мг) рассчитывают по формуле(разведения образца ЛЛФ-лио и СО борхлорина одинаковы):Х= А×а0/ А0,где: А и А0 – оптические плотности растворов образца ЛЛФ-лио и СОборхлорина соответственно; а0 – навеска СО борхлорина, в мг.Относительная погрешность определения борхлорина в ЛЛФ-лио поданной методике составила около 2% (Таблица 20).143Таблица 20Результаты количественного определения борхлорина в ЛЛФ-лио№ образца ЛЛФ- Оптическая плотность,Содержание борхлорина влио борхлоринаАобразце ЛЛФ-лио, мг/флакон10,4241,0120,4351,0430,4271,0240,4140,9950,4311,0360,4371,042-4Статистическиеn=6, f=5, хср=1,02, S =3,8×10 , S=1,95×10-2,характеристикиSхср.=7,96×10-3, t (Р, f)=2,57 (P=95%), ∆х=0,02, ε=1,96%На основании результатов, можно сделать вывод о том, что даннаяметодикапозволяетсбольшойточностьюопределятьсодержаниеборхлорина в ЛФ.4.2.6.ВалидацияметодикиспектрофотометрическогоанализаборхлоринаСпецифичностьСпецифичность – это способность аналитической методики даватьправильный результат определения вещества в присутствии сопутствующихкомпонентов.
Оценка специфичности методики представлена в разделе 4.2.2.Диапазон примененияМетодика количественного определения борхлорина в ЛЛФ-лиодолжна быть применима в интервале от 80 до 120% от номинальногозначения определяемой концентрации действующего вещества в ЛФ. Впределах заданного диапазона получаемые с использованием валидируемойметодики результаты должны иметь приемлемый уровень линейности,правильности и прецизионности.ЛинейностьЛинейность аналитической методики считается доказанной, если ввыбранном диапазоне применения можно показать прямо пропорциональное144соотношение между концентрацией исследуемого вещества в растворе исигналом детектора (фактором отклика).При валидации разработанной методики спектрофотометрическогоанализаеелинейностьпроверялиэкспериментальноизмерениеманалитических сигналов для 5 проб с различными концентрациямиборхлорина в диапазоне от 80 до 120%.
Причем значение оптическойплотности для каждой пробы получали путем расчета среднего значения изнескольких измерений.ДляэкспериментаготовилимодельныесмесиЛЛФ-лио,представляющие собой спиртовые растворы вспомогательных веществ иборхлорина с концентрациями действующего вещества от 0,2 до 0,3 мг/мл(Таблица 21). Для измерения оптической плотности модельную смесьразводилианалогичнолипосомальнойдисперсиипометодике,представленной в разделе 4.2.5.А.Таблица 21Составымодельныхсмесейдляоценкиметодикиспектрофотометрического анализа ЛЛФ-лио борхлорина по показателям«линейность» и «правильность»СоставМодельная смесь34100110125%8090120мг/мл(спиртовойборхлоринраствор0,2000,2250,2500,2750,300компонентовЛФ)мг0,80,91,01,11,2ФХ, мг180,0холестерин, мг32,0ПЭГ-ДГФА, мг3,0Примечание 1.
Сахарозу в состав модельных смесей не вводили, т.к. она очень малорастворима в этаноле 95% и в предварительном исследовании установлено, что данныйвспомогательный компонент не поглощает при (662±2) нм.Примечание 2. Приготовление модельной смеси липосомального борхлорина.
Точныенавески всех компонентов, указанных в таблице 21, растворяли в 3,7 мл спирта 95%(объем полученного спиртового раствора 4 мл).145Значение коэффициента корреляции составило более 0,999, чтосвидетельствует о наличии достаточно тесной линейной связи междуконцентрациейборхлоринаиоптическойплотностьювдиапазонеконцентраций от 80 до 120% (Таблица 22).Оценкалинейностиметодикиколичественного анализа борхлоринаКонцентрация борхлорина%мг/мл80901001101200,2000,2250,2500,2750,300Среднее значениеоптическойплотности, А0,3400,3730,4240,4550,512Статистические характеристикиНаклон прямой (b)Отрезок на оси ординат (а)Доверительный интервал (95%) bКоэффициент корреляции (R)Таблица 22спектрофотометрическогоРегрессия0,3340,3770,4210,4640,507Результаты1,726-0,0111,726±0,3020,9992Уравнение регрессии для данной линейной зависимости имеет виду=1,726х-0,011.
Графическое представление линейности методики показанона Рисунке 50.Рисунок 50. Графическое изображение регрессионной прямой линейности методикиколичественного анализа борхлорина в ЛФ при 662 нм.146Правильность (точность)Правильностьаналитическогометодахарактеризуетблизостьрезультатов испытаний, полученных данным методом, к истинномузначению.Правильность валидируемой методики устанавливали по результатамее применения к анализу модельной смеси, включающей все компоненты ЛФи известное количество определяемого вещества в пределах диапазонаприменения. С этой целью готовили по три модельные смеси для каждой изтрех концентраций: 80, 100 и 120%.
Оценку правильности методики наоснове 9 результатов проводили путем расчета процента восстановления(отклик), стандартного отклонения, коэффициента вариации, доверительногоинтервала среднего значения (Р=95%) и относительной погрешностисреднего результата (Таблица 23).Оценкаправильностиметодикиколичественного анализа борхлоринаТаблица 23спектрофотометрическогоБорхлорин, мгСодержаниеНайденноеборхлорина взначениемодельной смеси, мг10,840,868020,820,8330,830,8141,001,0110051,021,0361,001,0271,201,1812081,211,2091,211,21Статистические характеристики, %Наименьшее значениеНаибольшее значениеСреднее значениеСтандартное отклонениеКоэффициент вариацииДоверительный интервалОтносительная погрешностьКонцентрация,%№пробыОтклик, %102,38101,2297,59101,00100,98102,0098,3399,17100,00Результаты97,59102,38100,481,5941,59100,48±1,231,22147На основании полученных результатов, представленных в Таблице 23,разработанную методику спектрофотометрического анализа можно считатьправильной,таккакотклоненияотсреднегозначения(1,0±0,01)укладываются в интервал концентраций борхлорина (0,85-1,15 мг/флакон),заявленных в проекте НД на ЛЛФ-лио борхлорина, и относительнаяпогрешность среднего результата не превышает 2%.ПрецизионностьПрецизионность методики характеризуется рассеянием результатов,получаемыхсееиспользованием,относительнозначениясреднегорезультата.
Прецизионность методики спектрофотометрического анализаборхлоринаопределялипооценкеповторяемостирезультатовивнутрилабораторной прецизионности.А. Повторяемость (сходимость)Повторяемость аналитической методики оценивали по результатам,полученным в одинаковых условиях в одной лаборатории одним и тем жеисполнителем в пределах короткого промежутка времени. Испытаниепроводили на 6 образцах ЛЛФ-лио борхлорина одной серии. Критерийприемлемости выражался величиной коэффициента вариации.На основании полученных данных (Таблица 24) коэффициент вариациисоставил менее 10% (0,634%), что свидетельствует о незначительнойизменчивости вариационного ряда и прецизионности методики в условияхповторяемости.148Оценкаповторяемостиметодикиколичественного анализа борхлорина№ образца123456Статистические характеристикиНаименьшее значение, мг/флНаибольшее значение, мг/флСреднее значение, мг/флСтандартное отклонение, мг/флКоэффициент вариации, %Доверительный интервал, мг/флОтносительная погрешность, %Таблица 24спектрофотометрическогоСодержание борхлорина во флаконе, мг1,0861,1051,1051,0981,1001,098Результаты1,0861,1051,0990,0070,6341,099±0,0070,64Б.
Внутрилабораторная (промежуточная) прецизионностьДляопределенияпромежуточнойпрецизионностиизмерялисодержание действующего вещества в 6 пробах, полученных в условияхработы одной лаборатории разными аналитиками в разные дни.При анализе результатов определения концентрации борхлорина(мг/флакон)вразличныхусловиях(Таблица25)обнаружено,чторассчитанное значение критерия Фишера (Fрас=2,03) не превышало еготабличного значения (Fтаб=5,05) и, следовательно, различие дисперсий S2(1) иS2(2) статистически незначимо.
При сравнении расчетного и табличногозначения критерия Стьюдента также выполнялось неравенство tрас=0,33 <tтаб=2,23, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибкиизмерений. На основании вышеизложенного можно сделать вывод о том, чторасхождения результатов анализа, полученных двумя исследователями,случайны. Таким образом, установлена промежуточная прецизионностьспектрофотометрическойметодикиборхлорина в разработанной ЛФ.количественногоопределения149Таблица 25Оценкавнутрилабораторнойпрецизионностиметодикиспектрофотометрического количественного анализа борхлорина№ пробы123456Статистические характеристикиНаименьшее значение, мг/флНаибольшее значение, мг/флСреднее значение, мг/флДисперсия S2, мг/флСтандартное отклонение, мг/флКоэффициент вариации, %Доверительный интервал, мг/флОтносительная погрешность, %Fтаб (5%;5;5)=5,05tтаб (95%;10)=2,23Содержание борхлорина во флаконе, мгАналитик 1Аналитик 21,0861,1011,1051,0921,1051,0971,0981,1031,1001,1011,0981,106Результаты1,0861,0921,1051,1061,0991,1004,9×10-52,4×10-50,0070,0050,6340,4551,099±0,0071,100±0,0050,640,45Fрас=2,03tрас=0,33РобастностьРобастностьилиустойчивостьпроявляетсявспособностиконтрольного исследования сохранять неизменными свои характеристики,несмотря на преднамеренное внесение небольших изменений в различныепараметры работы аналитической системы, а также служит показателемнадежности исследования при нормальных условиях его проведения.Для определения устойчивости методики количественного определенияборхлорина в ЛФ исследовали стабильность аналитов во времени приизменении факторов внешней среды (воздействие света и температуры).Готовили образцы аналитических растворов путем разведения ЛЛФ-лиоборхлорина по методике количественного определения, указанной в разделе4.2.5.Б., измеряли их оптическую плотность и рассчитывали концентрациювещества в аналите сразу после получения и через определенные промежуткивремени.
При этом образцы аналитов делили на три серии и хранили вразличных условиях: первую серию образцов – при комнатной температуре в150незащищенном от света месте, вторую серию – при комнатной температуре взащищенном от света месте, третью серию – при температуре +2...+8ºС(Таблица 26).Таблица 26Мониторинг концентрации борхлорина в аналитах (мкг/мл) в процессехраненияПродолжительность хранения№пробы0ч2ч5ч24 ч4 сут14 сут28 сут1.
При комнатной температуре в незащищенном от света месте17,747,687,757,747,436,845,0327,817,757,777,817,586,905,0937,607,527,587,527,316,675,0347,687,667,667,667,376,805,1457,797,717,747,757,506,825,20хср7,727,667,707,707,446,815,102. При комнатной температуре в защищенном от света месте17,777,777,707,587,507,337,0727,817,777,797,747,647,497,3037,757,747,747,777,747,667,3947,717,747,707,707,687,477,0357,527,547,527,437,417,337,12хср7,717,717,697,647,597,467,183.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
