Диссертация (1141401), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Однако, несмотря на то, что данная система непозволяет одновременно провести ТСХ-анализ всех трех заявленныхкомпонентов ЛФ, ее можно использовать для определения борхлорина ихолестерина. Для идентификации холестерина в составе ЛФ также можноиспользовать систему 7 – хлороформ/аммиак (19:1) (Рисунок 38Б).БАРисунок 38. Вид хроматограммы:А – система 15 (бутанол/ледяная уксусная кислота/вода (6:3:2)),Б – система 7 (хлороформ/аммиак (19:1));1 – исследуемый образец ЛФ, 2 – СОВС-1, 3 – СОВС-2, 4 – СОВС-34.1.3. Выбор подвижной фазы для ТСХ-анализа ФХ, входящего в составЛФ борхлоринаПоскольку ни одна из предложенных систем не подходит дляобнаруженияФХ,необходимобылоподобратьдругуюсистемурастворителей для ТСХ-анализа этого компонента. В большинстве случаевдляразделенияианализаФЛиспользуютэлюирующиесистемы,содержащие в своем составе метанол [3, 93, 119].
Однако метанол является126токсичным и труднодоступным растворителем. Поэтому была проведенаработа по замене данного растворителя и подбору системы с болееприемлемыми составляющими.С этой целью в качестве подвижных фаз были изучены следующиесистемы растворителей (Таблица 17):1.хлороформ/этанол/пропанол/ледяная уксусная кислота/вода (6:4:2:2:1),2.хлороформ/этанол/ледяная уксусная кислота/вода (40:10:7:3),3.хлороформ/пропанол/вода (6:3:1),4.хлороформ/этанол/ледяная уксусная кислота/ацетон/вода (6:2:2:2:1),5.бутанол/хлороформ/ледяная уксусная кислота/вода (8:5:4:2),6.бутанол/хлороформ/этанол/ледянаяуксуснаякислота/вода(25:25:10:10:4),7.бутанол/ацетон/ледяная уксусная кислота/вода (5:3:1:1),8.ацетон/ледяная уксусная кислота/вода (15:3:2).Таблица 17Выбор подвижной фазы при ТСХ-анализе ФХ в составе ЛЛФ и ЛЛФ-лиоборхлоринаСистемаРастворителихлороформ/этанол/пропанол/ледяная уксусная кислота/водахлороформ/этанол/ледяная уксусная кислота/водахлороформ/пропанол/водахлороформ/этанол/ледянаяуксусная кислота/ацетон/водаЗначение Rf ФХЛФСОВС-2ВремяпробегаСоотношениеЕ6:4:2:2:118,60,33*0,29*2ч 15´40:10:7:340:7:7:540:7:7:340:5:7:56:3:16:2:2:1:16:2:2:2:16:2:2:4:112,814,011,714,217,916,517,317,90,500,410,41старт0,060,480,40*0,26*0,770,410,37старт0,040,480,36*0,23*3ч 35´2ч 10´2ч 15´4ч 10´1ч 45´2ч 35´2ч 10´1ч 50´0,210,123ч 50´0,120,073ч 10´0,060,062ч 25´0,020,021ч 35´бутанол/хлороформ/ледяная8:5:4:219,6уксусная кислота/ водабутанол/хлороформ/этанол/25:25:10:10:4 16,6ледяная уксусная кислота/водабутанол/ацетон/ледяная5:3:1:124,2уксусная кислота/водаацетон/ледяная уксусная15:3:225,4кислота/водаПримечание: * размытые пятна,Е – полярность подвижной фазы [60].127В системах 1, 7 и 8 определение ФХ было затруднено, посколькунаблюдалось нечеткое разделение хроматографических зон – образующиесяпятна имели размытый характер.В системах 3, 5-8 отмечалось хорошее разделение зон, однакоподвижность пятен ФХ была низкой и величина Rf имела значение не более0,21.В элюирующих системах 2 и 4 наблюдалось хорошее разделение пятенФХ, а величина Rf находилась в пределах 0,37-0,77 (Рисунок 39А, 39Б).Однако значения Rf пятен ФХ в ЛФ и стандартном растворе значительноразличались.АБРисунок 39.
Вид хроматограммы:А – система 2 (хлороформ/этанол/ледяная уксусная кислота/вода (40:10:7:3)),Б – система 4 (хлороформ/этанол/ледяная уксусная кислота/ацетон/вода (6:2:2:2:1))На качество разделения хроматографических зон оказывает влияние нетолькокачественныйсоставподвижнойфазы,ноисоотношениерастворителей, поэтому было решено изменить соотношения компонентов 2и 4 систем.
В подвижной фазе 2 (хлороформ/этанол/ледяная уксуснаякислота/вода (40:10:7:3)) изменяли содержание этанола и воды, а в128подвижной фазе 4 (хлороформ/этанол/ледяная уксусная кислота/ацетон/вода(6:2:2:2:1)) варьировали количество ацетона.При снижении доли этанола до соотношения 40:7:7:5 в системехлороформ/этанол/ледяная уксусная кислота/вода величина Rf пятен ФХ вЛФ и СОВС-2 достигла значения 0,41, а при использовании подвижной фазыхлороформ/этанол/ледяная уксусная кислота/ацетон/вода (6:2:2:1:1) пятнаФХ имели еще большее значение Rf – 0,48 (Рисунок 40А, 40Б).
Хотя времяхроматографированияприиспользованиисистемыхлороформ/этанол/ледяная уксусная кислота/ацетон/вода (6:2:2:1:1) большена 25 мин по сравнению с продолжительностью анализа в системехлороформ/этанол/ледяная уксусная кислота/вода (40:7:7:5), выбор сделан впользу первой из-за более высокой подвижности пятен ФХ.АБРисунок 40. Вид хроматограммы:А – система хлороформ/этанол/ледяная уксусная кислота/вода=40:7:7:5,Б – система хлороформ/этанол/ледяная уксусная кислота/ацетон/вода=6:2:2:1:1В ходе исследования было доказано, что выбранные системырастворителей подходят для идентификации борхлорина, ФХ и холестеринакак в свежеприготовленных липосомах, так и в лиофилизате. Совместныйанализ данныхкомпонентов исахарозызатруднен:из-завысокой129концентрации последней при обработке пластины раствором α-нафтолапроявляютсябольшиеразмытыепятна,нарушающиеобщуюхроматографическую картину и мешающие определению других веществ.Поэтому качественный анализ сахарозы проводился отдельно.4.1.4.
ТСХ-анализ сахарозы, входящей в состав ЛЛФ-лио борхлоринаПосколькусахарозаявляетсяводорастворимымсоединением,пробоподготовку анализируемой пробы осуществляли путем 100-кратногоразбавления липосомальной дисперсии водой.Приготовление исследуемого образца ЛЛФ-лио борхлоринаЛиофилизат регидратируют путем добавления 3,7 мл воды, 1 млполученной липосомальной дисперсии переносят в колбу вместимостью 100мл и доводят до метки водой.
Концентрация сахарозы 1 мг/мл.Приготовление СОВС-4 – водный раствор сахарозы 1 мг/млНавеску сахарозы 10,0 мг растворяют в 10 мл воды.Приготовление раствора α-нафтола0,5 г α-нафтола растворяют в 50 мл смеси спирта 95% иконцентрированной серной кислоты (19:1 по объему), количественнопереносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят до метки той жесмесью.Методика проведения анализаНа хроматографическую пластинку наносят по 2 мкл исследуемогообразца ЛЛФ-лио (сахароза – 2,0 мкг) и водного раствора СОВС-4 (сахароза– 2,0 мкг). Пластинку помещают в хроматографическую камеру с элюентом,плотно закрывают крышкой и хроматографируют восходящим способом.После достижения фронтом элюента линии финиша (пробег 12 см) пластинкувынимают из камеры и высушивают на воздухе до полного удаления запахарастворителя. Обнаружение пятен сахарозы проводят с использованиемреактива на основе α-нафтола в смеси спирта 95% и концентрированной130серной кислоты.
Пластинку опрыскивают раствором α-нафтола и нагревают всушильном шкафу до появления темно-фиолетовых пятен сахарозы.В качестве подвижной фазы исследовали системы, представленные вТаблице 18.Таблица 18Выбор подвижной фазы для ТСХ-анализа сахарозы в составе ЛЛФ-лиоборхлоринаСистема№РастворителиСоотношение1Хлороформ/этанол20:1Хлороформ/этанол/ледяная240:7:7:5уксусная кислота/водаХлороформ/этанол/ледяная36:2:2:1:1уксусная кислота/ацетон/вода4Хлороформ/аммиак 25%4:1Бутанол/ледяная уксусная56:3:2кислота/вода6Бутанол/этанол/вода6:3:2Ацетон/этилацетат/ледяная715:10:3:5уксусная кислота/водаАцетон/ледяная уксусная815:3:2кислота/водаПримечание: Е – полярность подвижной фазы [60].Е6,1Значение RfЛФСОВС-4стартстарт12,80,140,123ч 35´16,50,200,162 ч 35'7,40,920,921ч 20´26,80,350,283ч 30´30,90,350,373ч 40´24,30,440,361ч 25´25,40,550,551ч 35´Времяпробега1ч 05´При хроматографировании в системах 5 (бутанол/ледяная уксуснаякислота/вода (6:3:2)), 2 (хлороформ/этанол/ледяная уксусная кислота/вода(40:7:7:5)) и 3 (хлороформ/этанол/ледяная уксусная кислота/ацетон/вода(6:2:2:1:1)) отмечалось хорошее разделение зон, однако подвижность пятенбыла низкой и значения величин Rf в ЛФ и стандартном растворезначительно различались.В результате в качестве элюента для ТСХ-анализа сахарозы в составеЛФ выбрана система растворителей ацетон/ледяная уксусная кислота/вода(15:3:2) (8), которая обеспечивала хорошее разделение пятен сахарозы снаилучшим значением Rf – 0,55 (Рисунок 41).
Время пробега подвижной131фазы составило в среднем 1ч 35 мин. Пятна борхлорина, ФХ и холестеринапри анализе сахарозы на хроматографической пластинке не обнаруживались.Рисунок 41. Вид хроматограммы:система 8 (ацетон/ледяная уксусная кислота/вода (15:3:2))4.1.5.
Оценка пригодности хроматографических системПригодность системы – это характеристика аналитической методики,которая показывает надежность анализа в заданных условиях его проведения.Параметры пригодности системы обеспечивают применение метода в техслучаях, когда в процессе анализа возникают некоторые внутрилабораторныеизменения условий анализа [16].Оценкупригодностивыбранныххроматографическихсистемпроводили путем определения предела обнаружения вещества.В результате проведенных исследований установили, что пределобнаружения(минимальноесодержаниеанализируемоговещества,определяемого данным методом) борхлорина в системе бутанол/ледянаяуксусная кислота/вода (6:3:2) составил 0,1 мкг, холестерина – 1,0 мкг. ПределобнаруженияФХвсистемехлороформ/этанол/ледянаяуксуснаякислота/ацетон/вода (6:2:2:1:1) составил 1,0 мкг, а сахарозы в системеацетон/ледяная уксусная кислота/вода (15:3:2) – 0,1 мкг.132Оценка пригодности системы бутанол/ледяная уксусная кислота/вода(6:3:2)Приготовление исследуемого образца ЛФ борхлоринаК 2 мл регидратированной ЛЛФ-лио борхлорина (содержимое флаконарастворяют в 3,7 мл воды) прибавляют 3 мл спирта 95% и перемешивают.Концентрация борхлорина в полученном образце 0,1 мг/мл.Приготовление СОВС:СОВС-1 – спиртовой раствор борхлорина 0,1 мг/мл.
Приведено в разделе4.1.1.СОВС-3 – спиртовой раствор холестерина 3,2 мг/мл. Приведено в разделе4.1.1СОВС-3а – спиртовой раствор холестерина 1,0 мг/мл. Навеску холестерина10,0 мг растворяют в 10 мл спирта 95%.Приготовление 20% серной кислоты. Приведено в разделе 4.1.1.Методика проведения анализаНа линию старта хроматографической пластинки наносят пробы: 1 – 4мкл исследуемого образца ЛФ (борхлорин 0,4 мкг, холестерин 12,8 мкг), 2 –4 мкл СОВС-1 (борхлорин 0,4 мкг), 3 – 4 мкл СОВС-3 (холестерин 12,8 мкг),4 – 1 мкл СОВС-1 (борхлорин 0,1 мкг) и 5 – 1 мкл СОВС-3а (холестерин 1,0мкг). После подсушивания на воздухе пластинку с нанесенными пробамипомещают в хроматографическую камеру со смесью бутанол/ледянаяуксуснаякислота/вода(6:3:2),плотнозакрываюткрышкойихроматографируют восходящим способом.
После достижения фронтомэлюента линии финиша пластинку вынимают из камеры и высушивают впотоке теплого воздуха до полного удаления запаха растворителя. Борхлоринидентифицируют на пластинке визуально по характерным зеленым пятнамбез использования специфических реактивов. Обнаружение холестеринапроводят, опрыскивая пластинку 20% серной кислотой с последующим133нагреванием в сушильном шкафу до появления характерных розовофиолетовых пятен холестерина.Значения Rf при проверке пригодности системы растворителейбутанол/ледяная уксусная кислота/вода (6:3:2) составили (Рисунок 42):1 – исследуемый образец ЛФ: борхлорин (0,4 мкг) – 0,49, холестерин(12,8 мкг) – 0,67;2 – СОВС-1 (борхлорин 0,4 мкг) – 0,50;3 – СОВС-3 (холестерин 12,8 мкг) – 0,68;4 – СОВС-1 (борхлорин 0,1 мкг) – 0,50;5 – СОВС-3а (холестерин 1,0 мкг) – 0,67.Рисунок 42.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
