Диссертация (1141371), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Каждая партия приготовленной среды проходила контрольстерильности и ростовых свойств. Перечень и характеристика использованныхдля проведения исследований питательных сред приведены в таблице 2.4.Таблица 2.4 Питательные среды, использованные для изучения эффективностиантимикробного консервирующего действияНаименование средыСоево-казеиновый агарСоево-казеиновый агарЗаключение опригодностисредыНазначениеПодготовка рабочих культур тестштаммов бактерийОпределение общего числабактерийПригоднаПригоднаСабуро-глюкоза агар (безантибиотика)Подготовка рабочих культур тестштаммов грибовПригоднаСабуро-глюкоза агарОпределение общего числа грибовПригоднаТест-микроорганизмыПри проведении исследований использовали тест-микроорганизмы всоответствии с требованиями ГФ ХIІІ. Перечень тест-микроорганизмов приведенв таблице 2.5.Таблица 2.5 Тест-микроорганизмы, использованные для изучения эффективностиантимикробного консервирующего действияТест-микроорганизмНомер штаммаStaphylococcusaureusPseudomonasaeruginosaEscherichiacoliCandidaalbicansAspergillusnigerATCC 6538-РАТСС 9027АТСС 25922NСTС 885-653АТСС 16404Количество пассажей отисходного штамма4444336Тест-микроорганизмыбылиполученыизУкраинскойколлекциимикроорганизмов (УКМ).
Хранение тест-микроорганизмов осуществлялось всоответствии с документом «Порядок получения, учета, хранения и поддержаниятест-штаммовмикроорганизмовдляпроведенияконтролякачествалекарственных средств по микробиологическим показателям».Дляпроведенияисследованийготовилирабочиекультурытест-микроорганизмов в соответствии с требованиями ГФ ХІІI.
Каждый тестмикроорганизм выращивали отдельно на соответствующей питательной среде.Тест-штаммы бактерий выращивали на соево-казеиновом агаре при температуреот 30С до 35С от 18 ч до 24 ч. Тест-штаммы грибов выращивали на поверхностиплотной среды Сабуро-глюкоза агар (без добавления антибиотика) притемпературе от 20С до 25С. Тест-микроорганизм Candida albicans выращивали втечение 48 ч, тест-микроорганизм Aspergillus niger – в течение 7 суток. В деньиспытания готовили исходную суспензию каждого из тест-микроорганизмов.Для приготовления суспензий культур бактерий и культуры C.
albicansмикробную массу смывали с поверхности питательной среды изотоническимраствором натрия хлорида (9 г/л натрия хлорида). Для приготовления суспензиикультурыA. nigerиспользовалистерильнуюсуспендирующуюжидкость,содержащую 9 г/л натрия хлорида и 0,5 г/л полисорбата 80. Для каждого из тестмикроорганизмов в том же растворителе готовили исходную суспензию, котораясодержалаоколоиспользовали109 КОЕ/мл.классическийДляметодприготовленияисходнойсуспензиивизуальногосравнениямутностибактериальной суспензии со стандартом «мутности». Использовали стандарт«мутности» на 10 единиц с учетом индивидуальных особенностей суспензии,характерных для каждого из тест-микроорганизмов.
Инокулят – суспензию,которая содержала 108 КОЕ/мл, готовили путем разбавления исходной суспензиив 10 раз и использовали для инокуляции образцов при изучении эффективностиантимикробного консервирующего действия. Для определения точного числаКОЕ в инокуляте и исходного числа микроорганизмов при проведении испытанияготовили серийные десятикратные разведения инокулята в фосфатном буферном37растворе с натрия хлоридом и пептоном рН 7,0 и проводили высевы из каждогоприготовленного разведения на две чашки Петри с соответствующей плотнойпитательной средой.
Число КОЕ в 1 мл инокулята и исходное числомикроорганизмов определяли, исходя из среднего числа КОЕ на двух чашках ссоответствующим разведением инокулята.Дляпроверкимикроорганизмоввпригодностиметодикиинокулированныхопределенияобразцахдлячислакаждоготест-изтест-микроорганизмов методом серийных десятикратных разведений инокулятаготовили рабочую суспензию монокультуры, содержащую около 100 КОЕ/мл вфосфатном буферном растворе с натрия хлоридом и пептоном рН 7,0.
Точноечисло КОЕ каждого из тест-микроорганизмов в рабочих суспензиях, определялиметодом посева на чашки Петри с соответствующей плотной питательной средой.Для каждого из проведенных испытаний полученное точное значение числа КОЕкаждого из тест-микроорганизмов в рабочей суспензии приведено в таблице 2.6,как результат контрольного опыта.Таблица 2.6 Результаты проверки пригодности методики определения числажизнеспособных микроорганизмов в препарате налоксон спрей назальныйСреднее число КОЕ на чашках ПетриP. aeruginosaS. aureusE. coliC. albicansATCCATCCATCCNCTC90276538-P25922885-653A.
nigerАТСС16404Образецпрепарата6465822559Контроль6172882468Отношение числа КОЕ вприсутствии иотсутствиииспытуемого образца0,951,111,070,961,15Проверка пригодности методики определения числа жизнеспособныхмикроорганизмов в инокулированных образцах38Для каждого из тест-микроорганизмов была разработана методикаопределения числа жизнеспособных клеток в инокулированных образцах,позволяющая эффективно нейтрализовать антимикробное действие консерванта.Проверку пригодности разработанных методик определения общего числажизнеспособных микроорганизмов в инокулированных образцах проводили всоответствии с требованиями EPh 8.0. (2.6.12) [65]. Для каждого из тестмикроорганизмов, указанных в таблице 2.5, готовили рабочую суспензиюмонокультуры, содержащую около 100 КОЕ/мл тест-микроорганизма.Испытуемые образцы налоксона спрея назального готовили в соответствиис разработанной методикой.
В качестве растворителя использовали рабочиесуспензии монокультур тест-микроорганизмов, содержащие около 100 КОЕ/мл.Таким образом, при каждом испытании готовили пять образцов препарата. По1 мл каждого образца высевали двухслойным методом на необходимое числочашек Петри с соответствующей плотной питательной средой.Проводили контрольный опыт: по 1 мл каждой рабочей суспензии высевалина две чашки Петри с соответствующей питательной средой.Проводили инкубацию посевов в соответствии с требованиями EPh 8.0.(2.6.12) [65], подсчитывали число колоний на поверхности плотной питательнойсреды, определялисреднее арифметическоезначение числаколонийвприсутствии и отсутствии испытуемого образца.Общепринятых критериев пригодности методики определения числажизнеспособных микроорганизмов в инокулированных образцах при испытанииэффективности антимикробного консерванта, не существует.
Учитывая то, что всоответствии с требованиями EPh 8.0. (5.1.3) [65] методика должна бытьпригодной для доказательства требуемой интенсивности снижения числажизнеспособных микроорганизмов (минимальная значимая степень снижениясоставляет 10 раз), методику испытания считали пригодной в том случае, еслирезультаты подсчета числа колоний на чашках в присутствии и отсутствиииспытуемого образца отличались не более, чем в 2 раза.Испытание эффективности антимикробного консервирующего действия39Испытание эффективности антимикробного консервирующего действияпроводили в соответствии с требованиями общей статьи ГФ ХIІІ и EPh 8.0.
[4, 65].Испытание проводили методом, описанным ниже. Открывали хвостовойконец тубы и вносили в тубу инокулят из расчета 0,1 мл инокулята на 10 гналоксона спрея назального. Таким образом, микробная нагрузка составляла 105106 КОЕ в 1 г препарата налоксона спрея назального. Инокулированные образцытщательноперемешивалидляобеспеченияравномерногораспределениямикроорганизмов, после чего закрывали хвостовой конец тубы. Каждую из пятитуб с препаратом налоксон спрей назальный инокулировали суспензиеймонокультуры одного из тест-микроорганизмов. Инокулированные образцыхранили в течение 28 суток в защищенном от света месте при температуре от20 С до 25 С.
От испытуемых образцов отбирали пробы непосредственно послеинокуляции, через 2, 7, 14 и 28 суток и делали высевы на плотные питательныесреды для определения числа жизнеспособных клеток бактерий и грибов в 1 гпрепарата.Для каждого из тест-микроорганизмов была разработана методикаопределения числа жизнеспособных клеток в инокулированных образцах,позволяющая эффективно нейтрализовать антимикробное действие консерванта.Проверка пригодности методики определения числа жизнеспособныхмикроорганизмов в инокулированных образцах препарата налоксон спрейназальныйДляопределенияинокулированныхобразцахчислажизнеспособныхпрепаратаналоксонмикроорганизмовспрейназальныйвбыларазработана методика, приведенная ниже.Определение числа КОЕ тест-микроорганизмов S. aureus, E. Coli иP.
aeruginosa1 г препарата налоксон спрей назальный помещают в стерильный мерныйсосуд, доводят объем до 10 мл стерильным фосфатным буферным раствором снатрия хлоридом и пептоном рН 7,0 и тщательно перемешивают. При40необходимости делают серийные разведения полученного образца в том жерастворителе.По 1 мл полученного образца высевают двухслойным методом на две чашкиПетри с соево-казеиновым агаром. По 1 мл серийных разведений полученногообразца (при необходимости) высевают двухслойным методом на две чашкиПетри с соево-казеиновым агаром.Определение числа КОЕ тест-микроорганизмов C.
albicans1 г препарата налоксон спрей назальный помещают в стерильный мерныйсосуд, доводят объем до 10 мл стерильным фосфатным буферным раствором снатрия хлоридом и пептоном рН 7.0 и тщательно перемешивают. Принеобходимости делают серийные разведения полученного образца в том жерастворителе.По 1 мл полученного образца и, при необходимости, его серийныхразведений высевают двухслойным методом на чашки Петри с Сабуро-глюкозаагаром.Определение числа КОЕ тест-микроорганизмовA.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
