Диссертация (1141365), страница 6

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 6)

Концентрация ЛС может быть найдена в отсутствие стандартногообразца с использованием сигналов введённого в аналит в известнойконцентрации любого калибровочного соединения. В качестве последнего удобнорассматривать сигнал остаточных протонов дейтерированного растворителя,37применяемого при регистрации спектра ЯМР 1Н или количественно введённойдобавки с низкой летучестью, сигнал которой находится в свободной от другихсигналов области спектра [1, 22, 34, 35,36].2.2.1.1.

Методика количественного определения ИДН в геле – ЯМР 1НДля регистрации спектра ЯМР 1Н субстанции, 20,0 мг изосорбида динитратарастворяли в 600 мкл дейтерированного хлороформа (CDCl3), и переносили вампулу ЯМР (d = 5 мм). Спектр ЯМР 1Н регистрировали на приборе ECAJNM-600(JEOL, Япония) в следующих условиях: 32К точек на спектр, 90º импульс, времязадержки между импульсами 15 секунд, количество накоплений - 16. Спектр ЯМР1Н субстанции представлен на рисунке 2.3.Сигналы в области 3.90-4.20 м.д. соответствуют –O–CH2 протонам (4H),сигналы при 4.58 м.д.

(д, J=5.2 Гц, 1Н) и 5.00 м.д. (т, J=5.2 Гц, 1Н) соответствуют–O–CH протонам, сигналы при 5.33-5.42 м.д. соответствуют –СH–ONO2 протонам(2Н).Условия регистрации спектра ЯМР 1Н стандартного образца были такимиже, как и для субстанции. Спектр ЯМР 1Н стандартного образца представлен нарисунке 2.4. В качестве стандартного образца использовали изосорбид динитратстандарт ЕФ.При анализе геля, содержащего 0,5% ИДН, 1,0 г (точная навеска) гелярастворяли в 600 мкл CDCl3, откалиброванного по остаточному содержаниюпротонов,интенсивновстряхивалинавортексевтечениеминутыицентрифугировали.

Затем отбирали раствор из хлороформного слоя в ампулу дляЯМР. Условия регистрации спектра ЯМР 1Н - такие же, как и для субстанцииИДН. Спектр ЯМР 1Н ИДН в геле представлен на рисунке 2.5.38Рисунок 2.3. Спектр ЯМР1Н субстанции ИДН.Рисунок 2.4.

Спектр ЯМР1Н стандартного образца.39Рисунок 2.5. Спектр ЯМР 1Н геля, содержащего 0,5% ИДН.В присутствие в растворе полиэтиленгликоля-400, одного из основныхкомпонентов геля, сигналы ИДН смещаются в сильное поле и в спектре ЯМР 1Н(рисунок 2.5) геля для ИДН видны только 2 сигнала –СH–ONO2 протонов при 5.19м.д. (дт, J=5.4, J=2.3 Гц, 1Н) и 5.12 м.д. (д, J=3.6 Гц, 1Н) и сигнал –O–CH протонапри 4.78 м.д. (т, J=5.4 Гц, 1Н). Остальные сигналы ИДН перекрываются с другимикомпонентами геля.

Для количественного определения измеряли интегральнуюинтенсивность сигнала хлороформа и трёх сигналов ИДН. Массу ИДН в навескеопределяли по формуле:m - масса ИДН в навеске, Iи - интегральная интенсивность трёх сигналовИДН, nх - количество вещества хлороформа, Nх - количество протонов вхлороформе, Mи - молярная масса ИДН, Nи - количество протонов в ИДН, Iх интегральная интенсивность хлороформа.402.2.1.1.1. Валидация методики количественного определения – ЯМР 1НЧтобы доказать, что разработанная методика количественного определенияИДН в геле с помощью ЯМР-спектроскопии соответствует заложеннымкритериямприемлемостииможетиспользоватьсядляколичественногоопределения ИДН в геле, была проведена валидация методики. Необходимыетесты и критерии приемлемости методики были следующие: сходимость,точность, воспроизводимость.Приготовление испытуемых образцов и определение количественногосодержания ИДН в них проводили по описанной выше методике количественногоопределения. Сходимость (повторяемость)Тест на сходимость проводится в одинаковых условиях одним и тем желаборантом в один и тот же день путём выполнения 5 измерений одного и того жеобразца.

Для проверки сходимости выполнили пять определений количественногосодержания ИДН в геле.Критерий приемлемости: относительное стандартное отклонение приоценке сходимости должно быть не более 5,0 %.Критерии оценки: содержание ИДН в геле должно быть около 0,5%,относительное стандартное отклонение не более 5%Результаты определения содержания ИДН в геле и статистическойобработки полученных данных представлены в таблице 2.2.Таблица 2.2.Результаты испытания сходимости методики№123Массовое содержание ИДН, %0,480,490,50450,490,52Среднее массовое содержание ИДН, %0,49Стандартное отклонение ИДН, S, г/100 мл0,01Относительное стандартное отклонение ИДН,Sr, %2Приемлемость результатов для ИДН, уд/неудУдовлетворяет требованиям41 ТочностьЧтобы определить точности методики готовят 5 параллельных образцов изодной и той же серии и проводят количественное определение ИДН в геле.Критерий приемлемости: относительное стандартное отклонение при оценкеточности должно быть не более 5 %.Для оценки точности, приготовили пять параллельных образцов геля ИДН,провели в них определение количественного содержания ИДН.

Приготовлениеиспытуемых образцов и определение количественного содержания ИДНпроводили по описанной выше методике.Результаты определения и статистические данные представлены в таблице2.3.Таблица 2.3.Результаты испытания точности методики№12345Массовое содержание ИДН, %0,49 0,480,510,490,5Среднее массовое содержание ИДН, %0,49Стандартное отклонение ИДН, S, %0,01Относительное стандартное отклонение2ИДН, Sr, %Приемлемость результатов для ИДН,Удовлетворяет требованиямуд/неуд Воспроизводимость.В одном и том же образце проводят количественное определение ИДН надвух приборах, «Jeol JNM-ECA 600» и «Jeol JNM-ECS 400».Критерий приемлемости: относительное стандартное отклонение приоценке воспроизводимости должно быть не более 5 %.Для проверки воспроизводимости приготовили образец геля ИДН и провелив нем количественное определение ИДН на двух разных ЯМР-спектрометрах.Приготовление испытуемого образца и определение количественного содержания42ИДН проводили по описанной выше методике.

Результаты определения истатистические данные представлены в таблице 2.4.Таблица 2.4.Результаты испытания воспроизводимости методикиЯМР-спектрометрJeol JNM-ECA 600 Jeol JNM-ECS 400Содержание ИДН в %,0,490,48Среднее содержание ИДН в %0,485Стандартное отклонение ИДН, S, %0,007Относительное стандартное1,4отклонение ИДН, %Приемлемость результатов для ИДН,Удовлетворяет требованиямуд/неудРезультатыподтвердитьпроведённыхдостоверностьвсехданнойвышеуказанныхметодикидлятестовпозволяюткачественногоиколичественного определений ИДН в геле.2.2.1.2 Методика количественного определения ИДН в геле - ВЭЖХВ ходе наших исследований количество ИДН в геле так же определилиметодом ВЭЖХ в обращенно-фазовом режиме.Условия хроматографирования:прибор :Agilent 1200, США)жидкостной хроматограф с УФ-детектором;длина волны детектирования: 222,0 нм;колонка Protecol C18 4.6 мм×250 мм, 5 мкм;подвижная фаза - 0,1% водный раствор муравьиной кислоты (А) иацетонитрил (B);изократический режим: 60% А - 40% B;скорость подачи элюента - 0,5 мл/мин;объем вводимой в инжектор пробы - 10 мкл;43температура колонки 20°С;общее время анализа - 15 мин.Пробоподготовка геля для анализа включала следующие стадии: растворение навески геля (1,0 г) в хлороформе; отделение полимерного материала «Ареспол» путем фильтрования; упаривание раствора досуха; перерастворение сухого остатка в 1мл подвижной фазе.Пробоподготовка препарата сравнения: растворяют 5 мг в 1 мл подвижнойфазе, берут 10мкл раствора СО и водят в инжектор.По 10 мкл стандартного и испытуемого раствора хроматографируютпопеременно в указанных выше условиях.Содержание ИДН в процентах (Х) в геле рассчитывают по формуле:- площадь пика ИДН на хроматограмме испытуемого раствора;-площадьпикаИДНнахроматограммепрепарата(стандартного раствора);- навеска геля, г;- навеска препарата сравнения, г;P - содержание ИДН в препарате сравнения в процентах %.сравнения44Хроматограммы испытуемого раствора геля, и раствора стандартногообразца представлены на рисунке 2.6.Рисунок 2.6.

УФ-хроматограммы (λ=222,0 нм) раствора СО (А) и геля,содержащего 0,5% ИДН (Б).Результаты анализа выборки образцов геля методом ВЭЖХ подтверждаютколичественные данные, полученные методом спектроскопии ЯМР1Н. Этопозволяет рекомендовать оба этих метода для анализа геля, содержащего ИДН, по45разделам «Подлинность» и «Количественное определение». Содержание ИДН вгеле должно быть от 0.45% до 0,55%.2.2.1.3.

Методика количественного определения ИДН в креме – ЯМР 1НДля регистрации спектра ЯМР 1Н субстанции 20,0 мг изосорбида динитрата(ИДН) растворяли в 600 мкл CDCl3 и переносили в ампулу ЯМР (d = 5 мм).Спектр ЯМР 1Н регистрировали на приборе ECAJNM-600 (JEOL, Япония) вследующих условиях: 32К точек на спектр, 90º импульс, время задержки междуимпульсами 15 секунд, количество накоплений - 16. Спектр ЯМР 1Нпредставлен на рисунке 2.7.Рисунок 2.7. Спектр ЯМР 1Н ИДН.ИДН46Сигналы в области 3.90-4.20 м.д. соответствуют –O–CH2 протонам (4H),сигналы при 4.58 м.д. (д, J=5.2 Гц, 1Н) и 5.00 м.д. (т, J=5.2 Гц, 1Н) соответствуют–O–CH протонам, сигналы при 5.33-5.42 м.д. соответствуют –СH–ONO2 протонам(2Н).Условия регистрации спектра ЯМР 1Н стандартного образца были такимиже, как и для субстанции.

Спектр ЯМР 1Н стандартного образца представлен на. Вкачестве стандартного образца использовали изосорбид динитрат стандарт ЕФ.(рисунок 2.8).Рисунок 2.8. Спектр ЯМР1Н стандартного образца.47При анализе крема, содержащего 0,5% ИДН, 1,0 г (точная навеска) кремарастворяли в 1000 мкл CDCl3, откалиброванного по остаточному содержаниюпротонов,интенсивновстряхивалинавортексевтечениеминутыицентрифугировали. Супернатант отбирали в ампулу ЯМР. Условия регистрацииспектра ЯМР 1Н - такие же, как и для субстанции ИДН. (рисунок 2.9).В спектре крема присутствуют сигналы жировой основы которые,перекрывают некоторые сигналы ИДН.Рисунок 2.9.

Спектр ЯМР 1Н крема, содержащего ИДН.Дляколичественногоопределениябыливыбранысигналы,неперекрывающиеся сигналами от остальных компонентов: 3.93м.д. (дд, J=5.4Гц,J=11.3 Гц, 1Н), соответствующий одному из –O–CH2 протонов; сигналы при4.58 м.д. (д, J=5.2 Гц, 1Н) и 5.00 м.д.

(т, J=5.2 Гц, 1Н) соответствующие –O–CHпротонам. Измеряли интегральную интенсивность сигнала хлороформа и трёхсигналов ИДН Массу ИДН в навеске определяли по формуле:48m - масса ИДН в навеске, Iи - интегральная интенсивность трёх сигналовИДН, nх - количество вещества хлороформа, Nх - количество протонов вхлороформе, Mи - молярная масса ИДН, Nи - количество протонов в ИДН, Iх интегральная интенсивность хлороформа.Содержание ИДН в креме должно быть от 0.45% до 0,55%.2.2.1.3.1. Валидация методики количественного определения ИДН в креме –ЯМР 1НДля того чтобы подтвердить пригодность данной методики дляколичественного определения ИДН в креме, была проведена ее валидация покритериям: сходимость, точность, воспроизводимость.Приготовление испытуемых образцов и определение количественногосодержания ИДН в них проводили по описанной выше методике количественногоопределения. СходимостьДля проверки сходимости выполнили пять определений количественногосодержания ИДН в креме.Критерий приемлемости: относительное стандартное отклонение при оценкесходимости должно быть не более 5 %.Результаты испытания сходимости методики и статистической обработкиполученных данных представлены в таблице 2.5.49Таблица 2.5..Результаты испытания сходимости методики№123Массовое содержание ИДН, %0,48 0,49 0,5040,49Среднее массовое содержание ИДН, %0,49Стандартное отклонение ИДН, S, г/100 мл0,01Относительное стандартное отклонение ИДН,Sr, %Приемлемость результатов для ИДН, уд/неуд250,51Удовлетворяет требованиямТочностьДля испытания точности методики готовят 5 параллельных образцов изодной и той же серии и проводят количественное определение ИДН в креме.Критерий приемлемости: относительное стандартное отклонение при оценкеточности должно быть не более 5 %.Для оценки точности методики, приготовили пять параллельных образцовкрема ИДН, провели в них определение количественного содержания ИДН.Результаты испытания и статистические данные представлены в таблице 2.6.Таблица 2.6.Результаты испытания точности методики№Массовое содержание ИДН, %1230,490,480,51Среднее массовое содержание ИДН, %0,49Стандартное отклонение ИДН, S, г/100 мл0,01Относительное стандартное отклонение ИДН, Sr,%Приемлемость результатов для ИДН, уд/неуд450,49 0,502Удовлетворяет требованиям50Воспроизводимость.Для определения воспроизводимости методики, в одном и том же образцепроводят количественное определение ИДН на двух приборах, «Jeol JNM-ECA600» и «Jeol JNM-ECS 400».Критерий приемлемости: относительное стандартное отклонение при оценкевоспроизводимости должно быть не более 5 %.Для проверки воспроизводимости приготовили образец крема ИДН ипровели в нем количественное определение ИДН на двух разных ЯМРспектрометрах.

Характеристики

Список файлов диссертации