Диссертация (1141337), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Пластинку снанесенными пробами помещали вертикально в камеру с подвижной фазой,закрывали плотно крышкой и хроматографировали восходящим способомпри 20–25 °С в защищенном от света месте. После достижения фронтомподвижной фазы линии финиша (пробег 12 см) пластинку вынимали изкамеры и высушивали до полного удаления запаха растворителей. Дляобнаружения цифетрилина пластинку помещали в камеру, насыщеннуюпарами хлора и выдерживали на протяжении 5–10 мин. Послеопрыскивали 0,05 % водным раствором калия иодида до появления жёлтыхпятен цифетрилина. Для идентификации ЯФХ пластинку помещали вкамеру, насыщенную парами йода, и затем выдерживали 1–2 мин дообразования ярко-жёлтых пятен ФЛ.
Опрыскиванием пластинки 20 %серной кислотой с последующим нагреванием в сушильном шкафу дообразованиярозово-фиолетовыхпятенпроводилиобнаружениехолестерина.Значения Rf при проверке пригодности системы растворителейэтанол: аммиак водный 7 : 3 составили:1 – исследуемый образец ЛФ: цифетрилин (5 мкг) – 0,73, ЯФХ (265мкг) – 0,45;2 – СОВС-1 (цифетрилин 5 мкг) – 0,73;3 – СОВС-2 (ЯФХ 265 мкг) – 0,46;4 – СОВС-1А (цифетрилин 0,1 мкг) – 0,74;5 – СОВС-2А (ЯФХ 1,0 мкг) – 0,46.Таким образом, хроматографическую систему этанол: аммиакводный 7 : 3 можно считать пригодной, если на пластинке напротивСОВС-1 (цифетрилин 0,1 мкг) видно округлое пятно светло-желтого цвета,а после выдерживания пластинки в камере, насыщенной парами йода,напротив СОВС-2А (ЯФХ 1,0 мкг) обнаруживается пятно желтого цвета.98❖ Оценка пригодности хроматографической системы хлороформ :метанол = 9 : 1Налиниюавтоматическойстартапипеткойхроматографическойпо10мклпластинкиисследуемогонаносилиобразцаЛФ(содержание холестерина в наносимой пробе 27 мкг), СОВС-3 (содержаниехолестерина 27 мкг) и 1 мкл СОВС-3А (содержание холестерина 0,5 мкг) иподсушивали в токе воздуха.
Пластинку с нанесенными пробамипомещали вертикально в камеру с подвижной фазой, закрывали плотнокрышкой и хроматографировали восходящим способом при 20–25 °С взащищенном от света месте. После достижения фронтом подвижной фазылинии финиша (пробег 12 см) пластинку вынимали из камеры ивысушивали до полного удаления запаха растворителей.
Для обнаруженияхолестеринапластинкуопрыскивали20%сернойкислотойспоследующим нагреванием в сушильном шкафу до образования розовофиолетовых пятен.Значения Rf при проверке пригодности системы растворителейхлороформ : метанол = 9 : 1 составили:1 – исследуемый образец ЛФ: холестерин (27 мкг) – 0,63;2 – СОВС-3 (холестерин 27 мкг) – 0,64;3 – СОВС-3А (холестерин 0,5 мкг) – 0,64.Таким образом, хроматографическую систему хлороформ : метанол9 : 1 можно считать пригодной, если на пластинке напротив СОВС-3А(холестерин 0,5 мкг) видно округлое пятно розового цвета.994.1.2. Хроматографический анализ сахарозы в составе ЛЛФ-лиоцифетрилинаВыбор подвижной фазыДля выбора подвижной фазы ТСХ-анализа сахарозы сравнивалисистемы растворителей ацетон/ЛУК/вода (15 : 3 : 2) и хлороформ/нбутанол/ацетон/ЛУК/вода (25 : 25 : 15 : 5 : 4), применяемые для анализаданного вспомогательного вещества в липосомальных препаратах [3, 13].При использовании системы ацетон/ЛУК/вода (15 : 3 : 2) значение R fпятен сахарозы, соответствующим пробе ЛФ и СОВС-4, составило 0,72(Таблица 17).
Тогда как в системе хлороформ/н-бутанол/ацетон/ЛУК/вода(25 : 25 : 15 : 5 : 4) пятна анализируемого вещества для исследуемогообразца ЛФ и стандарта оставались на линии старта. В связи с этимподвижная фаза состава ацетон/ЛУК/вода (15 : 3 : 2) выбрана для ТСХанализа сахарозы в составе ЛЛФ-лио цифетрилина (Рисунок 18).Рисунок 18. Вид хроматограммы: ацетон/ЛУК/вода (15 : 3 : 2)1-исследуемый образец ЛФ, 2-СОВС-4Методика ТСХ-анализа сахарозы в составе ЛЛФ-лио цифетрилинаПриготовление исследуемого образца ЛЛФ-лио цифетрилина.
Лиофилизатрегидратируют путем добавления 10 мл воды, количественно переносят в100мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят водой до метки. В колбувместимостью 25 мл переносят 0,85 мл полученного разведения дисперсиии доводят водой до метки. Концентрация сахарозы в образце – 1 мг/мл.Приготовление СОВС-4 – водный раствор сахарозы 1 мг/мл. 25 мгсахарозы помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят водойдо метки.Приготовление раствора 1-нафтола.
Точную навеску 0,5 г 1-нафтоларастворяют в 50 мл смесь этилового спирта 95% и концентрированнойсерной кислоты (19 : 1), полученный раствор переносят в мерную колбувместимостью 100 мл и доводят той же смесью до метки.Подготовкахроматографическойкамеры.Вотдельнойёмкостисмешивают растворители, входящие в состав подвижной фазы, иполученную смесь переливают в хроматографическую камеру. Длянасыщения камеры парами смеси растворителей внутренние стенкиобкладывают фильтровальной бумагой, смоченной подвижной фазой.Камеру плотно закрывают крышкой и оставляют на 25–30 мин.Нанесение проб.
На линию старта хроматографической пластинки наносятавтоматической пипеткой по 5 мкл исследуемого образца ЛФ цифетрилина(содержание сахарозы в наносимой пробе 5 мкг) и СОВС-4 (сахароза 5мкг). Нанесенные пробы подсушивают в токе воздуха.Хроматографирование. Пластинку с нанесенными пробами помещаютвертикально в хроматографическую камеру с подвижной фазой, закрываютплотно крышкой и хроматографируют восходящим способом при 20–25 °С.Пластинку опрыскивают 0,5 % раствором 1-нафтола и нагревают допоявления темно-фиолетовых пятен сахарозы.Оценка пригодности хроматографической системы ацетон/ЛУК/вода(15 : 3 : 2)Предел обнаружения сахарозы в системе ацетон/ЛУК/вода (15 : 3 : 2)составляет 0,1 мкг.101ПриготовлениеисследуемогообразцаЛЛФ-лиоцифетрилина.см.методику выше.Приготовление СОВС:СОВС-4 – водный раствор сахарозы 1 мг/мл.
см. методику выше.СОВС-4А – водный раствор сахарозы 0,1 мг/мл. 5 мг сахарозы помещают вмерную колбу вместимостью 50 мл и доводят водой до метки.Приготовление раствора 1-нафтола. см. методику выше.Подготовка хроматографической камеры. см. методику выше.Проведение анализа. На линию старта хроматографической пластинкинаносили автоматической пипеткой по 5 мкл исследуемого образца ЛФ(содержание сахарозы в наносимой пробе 5 мкг) и СОВС-4 (содержаниесахарозы 5 мкг) и 1 мкл СОВС-4А (содержание сахарозы 0,1 мкг),подсушивали в токе воздуха. Пластинку с нанесенными пробамипомещали вертикально в камеру с подвижной фазой, закрывали плотнокрышкой и хроматографировали восходящим способом при 20–25 °С взащищенном от света месте.
После достижения фронтом подвижной фазылинии финиша (пробег 12 см) пластинку вынимали из камеры ивысушивали до полного удаления запаха растворителей. Для обнаружениясахарозы пластинку опрыскивали 0,5 % раствором 1-нафтола и нагревалидо появления фиолетовых пятен.Значения Rf при проверке пригодности системы растворителейацетон/ЛУК/вода (15 : 3 : 2) составили:1 – исследуемый образец ЛФ: сахароза (5 мкг) – 0,72;2 – СОВС-4 (сахароза 5 мкг) – 0,72;3 – СОВС-4А (сахароза 0,1 мкг) – 0,73.Таким образом, хроматографическую систему ацетон/ЛУК/вода (15 :3 : 2) можно считать пригодной, если на пластинке напротив СОВС-4А(сахароза 0,1 мкг) видно округлое пятно светло-фиолетового цвета.1024.2. Разработка методики спектрофотометрического анализацифетрилина в составе ЛЛФ и ЛЛФ-лио4.2.1.
Изучение спектральных характеристик действующего веществаи вспомогательных компонентов ЛЛФ цифетрилинаНа первоначальном этапе разработки методики количественногоспектрофотометрического определения цифетрилина в ЛЛФ изучалиспектральные характеристики ЛВ и вспомогательных веществ.В электронном спектре поглощения спиртового раствора субстанциицифетрилина в анализируемом диапазоне 250–800 нм обнаружено двамаксимума – при длинах волн (282 ± 2) и (290 ± 2) нм (Рисунок 19). Дляколичественного анализа липосомального цифетрилина выбран наиболееинтенсивный пик при (282 ± 2) нм.Рисунок 19. Электронный спектр поглощения спиртового раствора субстанциицифетрилина (концентрация цифетрилина в растворе 0,08 мкг/мл)Для того чтобы изучить влияние вспомогательных веществ наабсорбционныехарактеристикицифетрилинавЛЛФиЛЛФ-лиопроводили исследование спектра поглощения «пустых» липосом сдобавлением сахарозы.
В результате в диапазоне от 200 до 300 нм103обнаружены два пика при (268 ± 2) и (279 ± 2) нм, которые соответствуютмаксимумам поглощения вспомогательных компонентов ЛФ (Рисунок 20).Рисунок 20. Электронный спектр поглощения спиртового раствора «пустых» липосомс сахарозойУстановлено, что сахароза (Рисунок 21А) практически не поглощаетизлучение в диапазоне от 200 до 300 нм (А = 0,003), холестерин (Рисунок21В) и ПЭГ-ДГФА (Рисунок 21Г) имеют небольшое поглощение –суммарное значение оптической плотности (А) = 0,043.
В то же время вэлектронном спектре поглощения спиртового раствора ЯФХ обнаруженочетыре максимума при (203 ± 2), (258 ± 2), (268 ± 2) и (279 ± 2) нм(Рисунок 21Б), а значение А в аналитическом максимуме поглощенияцифетрилина (282 нм) составляет 0,352. Таким образом, липидныекомпонентымогутвлиятьназначениеоптическойплотностианализируемого раствора ЛФ, что следует учитывать при расчетеколичественного содержания цифетрилина в липосомах. Исходя из этого, вкачестве раствора сравнения для спектрофотометрического анализа ЛЛФцифетрилина предложено использование спиртового раствора «пустых»липосом.104ВАГБРисунок 21.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
