Диссертация (1141337), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Спектры поглощения: А. Раствор сахарозы (концентрация 9 мг/мл), Б.Раствор ЯФХ (концентрация 4мг/мл), В. Раствор холестерина (концентрация 0,4мг/мл),Г. Раствор ПЭГ-ДГФА (концентрация 0,05 мг/мл)4.2.2. Оценка соблюдения закона Бугера–Ламберта–БераДля установления линейной зависимости оптической плотности отконцентрации ЛВ и подбора разведения липосомальной дисперсии дляанализа готовили 10 образцов спиртовых разведений цифетрилина вдиапазоне концентраций от 0,02 до 0,2 мг/мл.Установлено, что при длине волны 282 нм поглощение спиртовогораствора цифетрилина во всём исследуемом интервале концентрацийподчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера (Рисунок 22, Таблица 18).Оптимальными для проведения количественного определения являлисьобразцы с концентрацией цифетрилина 0,04–0,12 мкг/мл, оптическаяплотность которых находилась в пределах 0,2–0,8.105Рисунок 22.
Оценка соблюдения закона Бугера–Ламберта–Бера при длине волны 282нм спиртового раствора цифетрилинаТаблица 18.Оптическая плотность спиртовых растворов цифетрилина при длине волны 282нм№12345678910Концентрация,10-5 г\мл2018161412108642Оптимальная плотность, придлине волны 282 ± 2 нм1,1631,0420,9280,8110,6990,5820,4710,3450,2510,1231064.2.3. Количественное определение цифетрилина в ЛЛФ и ЛЛФ-лиоА. Методика спектрофотометрического определения цифетрилина вЛЛФПриготовлениеСОцифетрилина.Кточнойнавескесубстанциицифетрилина 4,0 мг добавляют 20 мл спирта 95 %.
Полученный спиртовойраствор переносят в мерную колбу объемом 50 мл и доводят спиртом дометки. Раствор применяют свежеприготовленным.Приготовление раствора сравнения. 4 мл липосомальной дисперсии«пустых» липосом (см. 2.4.1.Б) помещают в мерную колбу объемом 50 мли доводят спиртом до метки. Раствор используют свежеприготовленным.Приготовление раствора исследуемого образца. В мерную колбу объемомв 50 мл помещают 4 мл липосомальной дисперсии цифетрилина,добавляют небольшое количество спирта 95 %, перемешивают и доводятспиртом до метки.Измеряют величину оптической плотности исследуемого раствора вкюветах с толщиной оптического слоя 10 мм в максимуме поглощения(282 ± 2) нм относительно раствора сравнения.
Параллельно проводятизмерение оптической плотности раствора СО субстанции цифетрилинаотносительно раствора сравнения.По формуле рассчитывали (разведения одинаковы) концентрациюцифетрилина в ЛЛФ (Х, мг/мл):Х= А × а0/ А0 × 4,где: А и А0 – соответственно оптические плотности растворов образцаЛЛФ и СО цифетрилина; а0 – навеска СО цифетрилина, в мг; 4 – 4 млобразца ЛЛФ цифетрилина.Относительная ошибка определения цифетрилина в ЛЛФ по даннойметодике составляет 0,71% (Таблица 19).107Таблица 19.Результаты количественного определения цифетрилина в ЛЛФКонцентрация№ образца ЛЛФОптическая плотность, А цифетрилина в образцецифетрилинаЛЛФ, мг/мл10,4480,9920,4581,0130,4531,0040,4701,0450,4521,0060,4651,03n=6, f=5, хср=1,01, S2=3,8×10-4, S=1,9×10-2,СтатистическиеSхср.=8,0×10-3, t (Р, f)=2,57 (P=95%), ∆х=0,02,характеристикиε=1,97 %Б. Методика спектрофотометрического определения цифетрилина вЛЛФ-лиоПриготовление СО цифетрилина.
Точную навеску 6,0 мг субстанциицифетрилина растворяют в 30 мл этилового спирта 95 %. В мерную колбуобъемом 100 мл количественно переносят полученный спиртовой раствори доводят спиртом до метки. Раствор применяют свежеприготовленным.Приготовление раствора сравненияВ мерную колбу объемом 100 мл помещают 6 мл липосомальнойдисперсии «пустых» липосом (см. 2.4.1.Б), добавляют небольшоеколичество этилового спирта 95%, перемешивают и доводят спиртом дометки. Раствор применяют свежеприготовленным.Приготовление раствора исследуемого образца. К содержимому флаконаЛЛФ-лио цифетрилина добавляют 5,3 мл воды и перемешивают дополучения однородной липосомальной дисперсии. В мерную колбуобъемом 100 мл количественно переносят полученную дисперсию, доводятспиртом 95 % до метки.Измеряют величину оптической плотности исследуемого раствора вкюветах с толщиной оптического слоя 10 мм в максимуме поглощения(282 ± 2) нм относительно раствора сравнения. Параллельно проводят108измерение оптической плотности раствора СО субстанции цифетрилинаотносительно раствора сравнения.Содержание цифетрилина во флаконе (Х, мг) рассчитывают поформуле (разведения образца СО цифетрилина и ЛЛФ-лио одинаковы):Х= А × а0/ А0,где: А и А0 – соответственно оптические плотности растворов образцаЛЛФ-лио и СО цифетрилина; а0 – навеска СО цифетрилина, в мг.По данной методике относительная погрешность определенияцифетрилина в ЛЛФ-лио составляет не более 1,5 % (Таблица 20).Таблица 20.Результаты количественного определения цифетрилина в ЛЛФ-лио№ образца ЛЛФОптическая плотность,Содержание цифетрилина влио цифетрилинаАобразце ЛЛФ-лио, мг/флакон10,3485,9320,3556,0530,3536,0240,3455,8850,3576,0960,3475,91Статистическиеn=6, f=5, хср=5,98, S2=7,2×10-3, S=8,49×10-2,характеристикиSхср.=3,46×10-2, t (Р, f)=2,57 (P=95%), ∆х=0,09, е=1,51%4.2.4.
Валидация методики спектрофотометрического анализацифетрилинаСпецифичностьСпецифичность – это способность аналитической методики даватьправильныйрезультатсопутствующихопределениякомпонентов.Длявеществаподтверждениявприсутствииспецифичностианалитической методики сравнивали электронные спектры поглощенияспиртовых растворов субстанции цифетрилина, вспомогательных веществи ЛЛФ-лио цифетрилина. Как видно на рисунке 23 в области 250–350 нмкривые спиртовых растворов субстанции и ЛЛФ-лио цифетрилина схожипо форме и положению пиков, однако оптическая плотность спиртовогораствора вспомогательных веществ в области аналитического максимумацифетрилина – (282 ± 2) нм – составляет значение 0,352, что значительно109влияет на расчеты концентрации ЛВ в ЛЛФ-лио. Таким образом, в ходеколичественного анализа цифетрилина измерение оптической плотностинеобходимо проводить относить раствора вспомогательных веществ или«пустых» липосом.Рисунок 23.
Оценка специфичности методики спектрофотометрического анализацифетрилинаДиапазон примененияМетодикаколичественногоопределениялипосомальногоцифетрилина должна быть применима в интервале 70–130 % отноминального значения определяемой концентрации ЛВ. Получаемыерезультаты с применением валидируемой методики в пределах указанногодиапазона должны обладать приемлемым уровнем линейности, точности ипрецизионности.ЛинейностьЛинейность аналитической методики считается доказанной, если ввыбранномдиапазонепримененияможнопоказатьпрямопропорциональное соотношение между концентрацией исследуемоговещества в растворе и сигналом детектора.Линейностьразработаннойметодикиспектрофотометрическогоанализа проверяли измерением аналитических сигналов 7 проб сразличными концентрациями цифетрилина в диапазоне от 70 до 130 % от110номинального значения. Для каждой пробы значение оптическойплотности получали с помощью расчёта среднего значения из несколькихизмерений.
Для проведения исследования готовили спиртовые растворыцифетрилина и вспомогательных веществ (модельные смеси ЛЛФ-лио) сконцентрациями действующего вещества от 0,7 до 1,3 мг/мл (Таблица 21).Модельную смесь для измерения оптической плотности разводилианалогично липосомальной дисперсии по методике, которая представленав разделе 4.2.3.А.Таблица 21.Составы модельных смесей для оценки методики спектрофотометрическогоанализа ЛЛФ-лио цифетрилина по показателям «правильность» и «линейность»Модельная смесьСостав1234567%708090100110120130мг/мл(спиртовойцифетрираствор0,70,80,91,01,11,21,3линкомпонентовЛФ)мг4,24,85,46,06,67,27,8ФХ, мг318318318318318318318холестерин, мг32323232323232ПЭГ-ДГФА, мг4444444Примечание. В состав модельных смесей сахарозу не вводили, поскольку онапрактически не растворима в 95 % этаноле и установлено в предварительномисследовании, что этот вспомогательный компонент не поглощает при (282 ± 2) нм.Значение коэффициента корреляции составило более 0,999%, чтосвидетельствует о наличии линейной зависимости между концентрациейоптической плотности и цифетрилина в диапазоне концентраций от 70 до130 % (Таблица 22).
Для подобной линейной зависимости уравнениерегрессии имеет вид у=0,37х-0,014 (Рисунок 24).111Таблица 22.Оценка линейности методики спектрофотометрического количественного анализацифетрилина№КонцентрацияКонцентрацияОптическаяРегреобразцацифетрилина, % цифетрилина, плотностьссиямг/млЗначение Среднеезначениепо 3-мобразцам1700,70,2460,2450,2460,245230,2444800,80,2820,2820,28150,28060,2837900,90,3150,3150,31680,31590,314101001,00,3550,3520,351110,348120,353131101,10,3830,3850,386140,385150,387161201,20,4220,4220,421170,422180,421191301,30,4570,4560,456200,455210,456Статистические характеристикиРезультатыНаклон прямой (а)-0,0026Отрезок на оси ординат (b)0,353Доверительный интервал (95%)0,353±0.007Коэффициент корреляции (R)0,999112Рисунок 24.
Графическое изображение регрессионной прямой линейности методикиколичественного анализа цифетрилина в ЛФ при 282 нм.Правильность (точность)Правильность аналитического метода определяется как близостьрезультатов испытаний к истинному значению, которые получены даннымметодом.Правильность методики оценивали путем анализа модельной смеси,которая включает все компоненты ЛЛФ цифетрилина и известноеколичество определяемого вещества в пределах диапазона применения.Изготавливали модельные смеси вспомогательных веществ с добавлениемнавески цифетрилина, соответствующей 70, 80, 90, 100, 110, 120 и 130 % отноминальной концентрации (Таблица 23).
На каждом уровне проводили по3 определения.Входеисследованияустановлено,чтополучаемыеэкспериментальные значения близки к истинным, а относительнаяпогрешность среднего результата не превышает 0,5 % (Таблица 23). Такимобразом, методику спектрофотометрического анализа липосомальногоцифетрилина можно считать правильной.113Таблица 23.Оценка правильности методики спектрофотометрического количественногоанализа липосомального цифетрилинаЦифетрилин, мгКонцентрация, % № образцаОтклик, %ИстинноеНайденноезначениезначение14,244,2199,297024,204,1999,7634,204,1799,2944,814,82100,218054,824,7999,3864,824,84100,4175,405,3899,639085,405,3899,6395,405,3799,44106,016,07101,00100116,005,9599,17126,036,03100136,636,5598,79110146,606,5899,70156,606,62100,3167,207,21100,14120177,217,21100,00187,217,2099,86197,827,8199,87130207,807,7899,74217,807,7999,87Статистические характеристики,РезультатыНаименьшее значение98,79%Среднее значение99,78%Наибольшее значение101,00%Стандартное отклонение1,031Доверительный интервал99,78 ± 0,47Коэффициент вариации1,033Относительная погрешность0,47ПрецизионностьПрецизионность методики характеризуется рассеянием получаемыхс ее использованием результатов относительно значения среднегорезультата.Прецизионностьспектрофотометрическогопроводилипутеманализаоценкивалидируемойметодикилипосомальногоцифетрилинаповторяемостивнутрилабораторной прецизионности.114результатовиА.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
