Диссертация (1141337), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Длянасыщения камеры парами смеси растворителей внутренние стенкиобкладывают фильтровальной бумагой, смоченной подвижной фазой.Камеру плотно закрывают крышкой и оставляют на 25–30 мин.Подготовка йодной камеры. В тигель отвешивают 1,0 г кристаллов йода,помещают на дно эксикатора и оставляют на 10–15 мин для возгонки йода.Подготовка камеры, насыщенной парами хлора. В стакан отвешивают 2,0г калия перманганата, помещают на дно эксикатора и медленно приливают6 мл концентрированной соляной кислоты. Оставляют на 4–5 мин дляобразования паров хлора.Приготовление 0,05 % водного раствора калия иодида. 25 мг калия иодидарастворяют в 50 мл воды.91Приготовление 20 % серной кислоты. К 100 мл воды при помешиванииналивают 25 мл концентрированной серной кислоты.Нанесение проб.
На линию старта хроматографической пластинки наносятавтоматическойпипеткойпо10мклисследуемогообразцаЛФцифетрилина (содержание цифетрилина в наносимой пробе 5 мкг, ЯФХ –265 мкг, холестерин – 27 мкг), СОВС-1 (содержание цифетрилина 5 мкг),СОВС-2 (содержание ЯФХ 265 мкг) и СОВС-3 (содержание холестерина27 мкг). Нанесенные пробы подсушивают в токе воздуха.Хроматографирование. Пластинку с нанесенными пробами помещаютвертикально в хроматографическую камеру с подвижной фазой, закрываютплотно крышкой и хроматографируют восходящим способом при 20–25 °Св защищенном от света месте.
После прохождения фронтом подвижнойфазы расстояния пробега (12 см) пластинку вынимают из камеры и впотоке тёплого воздуха высушивают до полного удаления запахарастворителей.Детектирование зон адсорбции и идентификация. Для обнаруженияцифетрилина пластинку помещают в камеру, насыщенную парами хлора ивыдерживают на протяжении 5–10 мин. После опрыскивания 0,05 %водным раствором калия иодида появляются жёлтые пятна цифетрилина.Для идентификации ЯФХ пластинку помещают в камеру, насыщеннуюпарами йода, и затем выдерживают 1–2 мин до образования ярко-жёлтыхпятен ФЛ. Совместно с ЯФХ проявляются светло-желтые быстроисчезающие пятна холестерина. Опрыскиванием пластинки 20 % сернойкислотой с последующим нагреванием в сушильном шкафу до образованиярозово-фиолетовых пятен проводят обнаружение холестерина.
В связи снизкой концентрацией в анализируемых пробах (0,3 мг/мл) ПЭГ-ДГФА неопределялся.Проявившиесяпятналипосомальнойпробыидентифицируютотносительно пятен СОВС и характеризуют по фактору удерживания R f,который рассчитывают по формуле:92Rf = а / b,где: а – расстояние от точки нанесения пробы (линия старта) до центрапятна, характеризующего зону адсорбции, мм;b – расстояние от линии старта до линии финиша элюента, мм [2].Выбор подвижной фазыПодбор подвижной фазы для разделения цифетрилина и липидныхкомпонентов смеси осуществляли на основе сравнения эффективностидевяти систем-элюентов, которые включают разные по сродству иполярности к неподвижной фазе растворители: аммиак водный, ацетон,бутанол, вода, ледяная уксусная кислота (ЛУК), метанол, пропанол,хлороформ, этанол и этилацетат (Таблица 17).
Оценку эффективностисистемы растворителей проводили по следующим параметрам:• количество зон адсорбции (пятен) веществ, образующихся приразделении смеси компонентов;• значение фактора удерживания Rf анализируемых веществ;• время пробега подвижной фазы.93Таблица 17.№ Подвижная фазаВыбор подвижной фазы для ТСХ-анализа ЛЛФ цифетрилинаЗначение RfЦифетрилинЯФХЛФЛФСОВС-1СОВС-2ВремяХолестеринСахарозаЛФЛФСОВС-3СОВС-41 ч 10мин2 ч 35мин3 ч 5 мин4 ч 10мин4 ч 20мин1 ч 10мин2 ч 15мин1 ч 30мин2 ч 10мин1хлороформ–метанол (9 : 1)0,170,180,080,080,630,64--2этанол–аммиак водный (7 : 3)0,730,730,450,471,001,00--3пропанол–ЛУК–вода (12 : 3 : 1)0,680,680,060,060,710,73--4пропанол–ЛУК–вода (22 : 12 : 3)0,580,660,050,061,001,00--5бутанол–ЛУК–вода (6 : 3 : 2)ХвостХвост0,080,110,770,77--6хлороформ–ацетон–этанол–ЛУК–вода(6 : 5 : 2 : 2 : 1)0,850,830,040,040,860,88--7ацетон–этилацетат–ЛУК (3 : 2 : 1)1,001,00ХвостХвост1,001,00--8ацетон–ЛУК–вода (15 : 3 : 2)0,930,930,030,040,980,97--9ацетон–этилацетат–ЛУК–вода(15 : 10 : 3 : 5)1,001,00СтартСтарт1,001,00--ацетон–ЛУК–вода (15 : 3 : 2)------0,720,721 ч 20минхлороформ–н-бутанол–ацетон–ЛУК–вода (25 : 25 : 15 : 5 : 4)------стартстарт1 ч 35мин1011Примечание: СОВС – стандартный образец вещества-свидетеля94Включение в состав элюента таких высокополярных компонентовкак метанол, ацетон, этанол и аммиак (системы 1, 2, 6–9) значительносокращалось время пробега элюента.
Однако при использовании данныхсистемрастворителейнаблюдалисьразличныехроматографическиекартины, характеризующиеся различным количеством зон адсорбции изначениями Rf анализируемых веществ.Так при использовании системы 1 (хлороформ : метанол = 9 : 1) вотличие от 6 (хлороформ : ацетон : этанол : ЛУК: вода = 6 : 5 : 2 : 2 : 1)значения Rf цифетрилина исследуемой пробы и СОВС были меньше в 5раз, холестерина – в 1,3 раза. В тоже время значение Rf для ЯФХ прихроматографировании в системе 1 оказался в 2 раза больше чем в системе2.При наличии в подвижной фазе ацетона (системы 6–9) наблюдаласьзначительная подвижность цифетрилина и холестерина и соответствующиеим пятна перемещались по пластинке практически с фронтом элюента –значенияRfсоставилизначения≥0,83.ПятнаЯФХприхроматографировании в данных системах детектировались вблизи линиистарта, а в случае подвижной фазы ацетон: этилацетат : ЛУК = 3 : 2 : 1 неопределялись.Включение в состав системы растворителей пропанола и бутаноласпособствовало увеличению продолжительности времени анализа иснижению подвижности цифетрилина и холестерина.
Однако в случаяхиспользования систем 3 и 5 отмечалось ухудшение разделения веществ: всистеме пропанол : ЛУК : вода = 12 : 3 : 1 наблюдалось наложение пятенхолестерина на пятна цифетрилина, в системе бутанол : ЛУК: вода = 6 : 3 :2 – размытие зоны адсорбции цифетрилина в виде «хвоста», что мешалоидентификациианализируемыхвеществ.Изменениеобъемногосоотношения растворителей в смеси пропанол: ЛУК: вода до 22 : 12 : 3способствовало значительному увеличению подвижности холестерина (Rf95= 1,00), а пятна цифетрилина исследуемой пробы и СОВС-1 имелиразличные значения Rf – 0,58 и 0,66, соответственно.В результате исследования для идентификации цифетрилина и ЯФХбыла выбрана система растворителей этанол: аммиак водный 7 : 3, прикоторой достигалось увеличение подвижности ФЛ и обеспечивалосьэффективное разделение данных веществ (Рисунок 17А).
Поскольку вданном системе пятна холестерина анализируемой пробы и СОВС-3поднимается с фронтом растворителей до линии финиша, для ТСХ-анализаэтого компонента в составе ЛФ выбрана подвижная фаза хлороформ :метанол = 9 : 1 (Рисунок 17Б).БАРисунок 17. Вид хроматограммы: А – система 2 (Этанол/аммиак водный (7 : 3)):1 – исследуемый образец ЛФ, 2 – СОВС-1, 3 – СОВС-2, 4 – СОВС-3;Б – система 7 (хлороформ /метанол (9 : 1)): 1 – исследуемый образец ЛФ, 2 – СОВС-3Предел обнаружения и оценка пригодности хроматографическойсистемыПредел обнаружения – это наименьшее количество (концентрация)определяемого вещества в образце, которое может быть обнаружено (илиприближенно оценено) с использованием валидированной методики [2].ДляопределенияпределаобнаружениякомпонентовЛЛФцифетрилина проводили испытания образцов с различными известными96количествами анализируемого вещества – цифетрилина, ЯФХ, холестерина)иустанавливалиминимальноезначение,прикоторомвозможноидентифицировать компонент ЛФ на хроматограмме.
В результатеобнаружено, что предел обнаружения цифетрилина в системе этанол:аммиак водный = 7 : 3 составил 0,1 мкг, ЯФХ – 1,0 мкг. Пределобнаружения холестерина в системе хлороформ : метанол = 9 : 1 составил0,5 мкг.Установлениепределаобнаруженияанализируемыхвеществпозволило провести оценку пригодности выбранных хроматографическихсистем.Приготовление исследуемого образца ЛФ цифетрилина. см.
методикувыше.Приготовление стандартных образцов веществ-свидетелей (СОВС):СОВС-1 – спиртовой раствор цифетрилина 0,5 мг/мл. см. методику выше.СОВС-1А – спиртовой раствор цифетрилина 0,1 мг/мл. 1,0 мгцифетрилина растворяют в 10 мл спирта 95%.СОВС-2 – спиртовой раствор ЯФХ 26,5 мг/мл. см. методику вышеСОВС-2А – спиртовой раствор ЯФХ 1 мг/мл. 10,0 мг ЯФХ растворяют в10 мл спирта 95 %.СОВС-3 – спиртовой раствор холестерина 2,7 мг/мл. см. методику выше.СОВС-3А – спиртовой раствор холестерина 0,5 мг/мл. 5,0 мг холестеринарастворяют в 10 мл спирта 95 %.Подготовка хроматографической камеры, йодной камеры и камеры,насыщенной парами хлора. см.
методику выше.Приготовление 0,05 % водного раствора калия иодида и 20 % сернойкислоты. см. методику выше.❖ Оценка пригодности системы этанол: аммиак водный 7 : 3Налиниюавтоматическойстартапипеткойхроматографическойпо10мклпластинкиисследуемогонаносилиобразцаЛФ(содержание цифетрилина в наносимой пробе 5 мкг, ЯФХ – 265 мкг),97СОВС-1 (содержание цифетрилина 5 мкг), СОВС-2 (содержание ЯФХ 265мкг), по 1 мкл СОВС-1А (содержание цифетрилина 0,1 мкг) и СОВС-2А(содержание ЯФХ 1 мкг) и подсушивали в токе воздуха.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
