Диссертация (1141337), страница 11
Текст из файла (страница 11)
В качестве основного компонента,формирующего мембрану липосом, использовали ЯФХ, что объясняетсяналичием у него таких положительных с технологической и биологическойточекзрениясвойствкакприемлемаяТф.п.(+37°С),хорошаярастворимость в органических растворителях, биосовместимость иприродное происхождение. Холестерин вводили в состав липосом дляприданиябислоюнеобходимогоуровняжёсткостииповышениястабильности получаемых фосфолипидных везикул в кровотоке. Длясозданияstealth-липосомцифетрилинавегосоставвводилифосфатидилэтаноламин, конъюгированный с гидрофильным полимером, –ПЭГ-ДГФА.На основании указанных липидов, получали и исследовалимодельные составы ЛЛФ цифетрилина с различными молярнымисоотношениямикомпонентов прописис учетом наличияу негогидрофобных свойств.
Для приготовления липосом цифетрилина покаждому исследуемому составу применяли «пленочный» метод. Липиднуюпленку гидратировали водой для инъекций с образованием липосомальнойдисперсии с концентрацией цифетрилина 1,0 мг/мл, которую затемэкструдировали с использованием нейлоновых и поликарбонатныхфильтров.63Качество липосомальных дисперсий цифетрилина, приготовленныхпо модельным составам, оценивали по следующим основным показателям– средний размер везикул после экструзии и уровень включения активноговещества в липосомы (КВП, %) (Таблица 5). В связи с тем, что за счетособенностейстроениястенкиопухолевыхсосудоввнейпреимущественно накапливаются частицы, имеющие диаметр порядка100–200 нм, данные размеры приняты в качестве оптимальных.Таблица 5.Модели составов липосомальной лекарственной формы цифетрилинаМолярные соотношения№Размер послеКВП, %состава цифетрилин/ЯФХ ЯФХ/Хол/ПЭГ-ДГФАэкструзии, нмосадок-155 ± 872 ± 21 : 0,2 : 0,014150 ± 1079 ± 141 : 0,14 : 0,009157 ± 1065 ± 351 : 0,3 : 0,019192 ± 678 ± 11 : 0,2 : 0,014191 ± 688 ± 171 : 0,14 : 0,009192 ± 682 ± 181 : 0,2 : 0,014180 ± 697 ± 11 : 0,14 : 0,014190 ± 689 ± 11 : 0,1 : 0,014196 ± 682 ± 11 : 0,2 : 0,014192 ± 680 ± 211 : 331 : 0,4 : 0,028231 : 4461:6691:7010111:75Примечания: ЯФХ – яичный фосфатидилхолин, Хол – холестерин, ПЭГ-ДГФА –полиэтиленгликоль-2000-дистеароилфосфатидилэтаноламин, КВП – количествовключенного препаратаПервоначальноисследовалимодельныйсоставс молярнымисоотношениями цифетрилин/ЯФХ = 1 : 33 и ЯФХ/Хол/ПЭГ-ДГФА = 1 :0,4 : 0,028.
В результате после отстаивания липосомальной дисперсиинаблюдали образование осадка, что свидетельствует о низком уровневключенияцифетрилина.Посколькуцифетрилинсвязываетсянепосредственно с главным формирующим компонентом бислоя – ЯФХ,64далее увеличили содержание данного компонента в ЛФ до соотношенияцифетрилин/ЯФХ = 1 : 44 (составы 2–4). После экструзии дисперсии МСЛ,приготовленной с использованием состава 2, получены везикулы сосредним размером 155 нм, а включение цифетрилина оказалосьнедостаточно высоким – 72 %.
При снижении доли Хол и ПЭГ-ДГФАотносительно фосфотидидхолина до соотношения ЯФХ/Хол/ПЭГ-ДГФА =1 : 0,2 : 0,014 (состав 3) позволило увеличить инкапсулированиецифетрилина до 79 %, однако дальнейшее уменьшение содержания Хол иПЭГ-ДГФА в составе 4 способствовало ухудшению качества липосом –наблюдалось образование более крупных везикул при экструзии изначительному снижению включения в среднем до 65 %.Далее постепенно повышали общее содержание липидов в ЛФотносительно цифетрилина, при этом изменяя как молярные соотношенияцифетрилин/ЯФХ, так и ЯФХ/Хол/ПЭГ-ДГФА. С ростом концентрациилипидных компонентов, главным образом фосфотидилходина, наблюдалиобразование везикул диаметром 180 нм и более, что обусловленоповышениемвязкостилипосомальнойдисперсииитемсамымзатрудненным процессом фильтрации и экструзии.
Однако повышениеконцентрации липидов в прописи позволило значительно сократить потериЛВ при фильтрации, увеличив инкорпорирование цифетрилина влипосомы с 79 (состав 3) до 97 % (состав 8). При этом отмечалось, чтоизменениедолихолестеринаиПЭГ-ДГФАотносительнофосфотидилхолина в соотношении ЯФХ/Хол/ПЭГ-ДГФА = 1 : 0,2 : 0,014как в сторону увеличения (состав 5), так и в сторону уменьшения (составы7, 9 и 10), способствовало снижению уровня включения цифетрилина иукрупнению везикул.В результате из всех исследуемых моделей с приемлемым размеромвезикул (180 ± 6 нм) и минимальными потерями цифетрилина в результатефильтрации и экструзии, а соответственно с самым высоким количествомвключенного ЛВ в липосомы (97 ± 1), для получения ЛЛФ был выбран65состав 8 с молярными соотношениями компонентов цифетрилин/ЯФХ = 1 :70 и ЯФХ/Хол/ПЭГ-ДГФА = 1 : 0,2 : 0,014.3.1.2.
Введение антиоксиданта в состав ЛЛФ цифетрилинаФЛ,содержащиененасыщенныесвязи,вчастностифосфотидилхолин, в процессе хранения и при приготовлении ЛФ с ихиспользованиемподвергаютсяперекисномуокислению.Изменениеструктуры и свойств природных липидов вследствие естественногоокисления приводит к дестабилизации структуры формируемых из нихлипосом и к затруднению включения активной субстанции в липидныйбислой или во внутреннее пространство липидной везикулы. Приокислении ненасыщенных липидов происходит перегруппировка двойныхсвязей в диеновую конъюгированную систему; конечным продуктомперекисногоокисленияявляетсямалоновыйдиальдегид.Дляпредотвращения и замедления ПОЛ в состав ЛЛФ вводят специальныевещества – антиоксиданты (АО), например, витамин Е (α-токоферол, VЕ),С (аскорбиновая кислота) [8].Для оценки влияния АО на качество ЛЛФ цифетрилина проводилиисследованиепосравнениюсодержанияМДАвлипосомальныхдисперсиях, приготовленных с введением в состав ЛФ α-токоферолаацетата и без него.
Масляный раствор α-токоферола добавляли кхлороформному раствору компонентов ЛФ до его упаривания на роторномиспарителе в молярных соотношениях VЕ/ЯФХ 1:60, 1:30 и 1:20.Содержание МДА в пробах определяли по методике, представленнойв разделе 2.3.4. Результаты исследования приведены в таблице 6.Согласно полученным данным добавление АО не оказало должноговлияния на ПОЛ липидов в ЛЛФ цифетрилина: разница концентрацийМДА в образцах ЛЛФ с использованием АО и без него незначительна.
Приприготовлении липосомальной дисперсии без добавления α-токоферолаконцентрация МДА составила значение 15,20 нмоль/мл. При введении в66состав ЛФ АО в молярном соотношении VЕ/ЯФХ 1 : 60 отмечалосьувеличение концентрации МДА до 19,46 нмоль/мл, а 1 : 30 – до 15,61нмоль/мл. Вероятно, АО в данных случаях не способствует снижениюокислительного процесса липидов, а наоборот приводит к повышениюскорости ПОЛ. Антиоксидантное действие α-токоферола наблюдалось придобавлении в ЛФ в соотношении VЕ/ЯФХ 1 : 20, поскольку определяемаяконцентрация МДА оказалась наименьшей – 13,24 нмоль/мл. Однако былозамечено, что с ростом содержания масляного раствора α-токоферола в ЛФзатрудняетсятехнологическийпроцессполучениялипосомальнойдисперсии цифетрилина – значительно снижается скорость гидратациилипидной пленки и последующей экструзии.Таблица 6.Концентрация МДА в образцах ЛЛФ цифетрилинаСоставМолярное№ соотношениеVE/ЯФХ1Без витаминаЕ21:6031:3041:20№образцаD532D580ΔDС12340,5450,4300,4360,4330,1500,0400,0420,0400,3950,3900,3940,39315,2915,1015,2515,2150,4370,0460,39115,141234512345123450,6100,4810,5930,5990,5760,5180,4760,4890,5390,4920,6170,5000,4680,6290,6060,0830,0020,0710,1020,0880,1160,0780,0630,1350,0810,2820,1590,1200,2760,2680,5270,4790,5220,4970,4880,4020,3980,4260,4050,4110,3350,3410,3480,3530,33320,4018,5420,2119,2418,8915,5614,4116,4915,6815,9112,9713,2013,4713,6612,8967Метрологическиехарактеристики(P = 95%, tp,f = 2.78)n = 5, f = 4, хср.
= 15,20,S2 = 0,061, S = 0,0779,Sхср = 0,0349,Sn = 0,0051,Δх = 0,0968, ε = 0,64 %n = 5, f = 4, хср. = 19,46,S2 = 0,667, S = 0,8164,Sхср = 0,3651,Sn = 0,042,Δх = 1,015, ε = 5,22 %n = 5, f = 4, хср. = 15,61,S2 = 0,678, S = 0,8234,Sхср = 0,3682,Sn = 0,053,Δх = 1,024, ε = 6,56 %n = 5, f = 4, хср. = 13,24,S2 = 0,1816, S = 0,4261,Sхср = 0,1906,Sn = 0,032,Δх = 0,53, ε = 4,00 %Таким образом, поскольку исследованный АО практически неоказывает протекторного действия в отношении липосомальных липидов,а также отрицательно влияет на технологический процесс полученияпрепарата, сделан вывод о нецелесообразности включения α-токоферола всостав ЛЛФ цифетрилина.3.2. Разработка технологии получения ЛЛФ-лио цифетрилинаТехнология получения липосомального цифетрилина включаетследующие основные критические стадии, особенности разработкикоторых рассмотрены в данной работе:1.
Получение липидной пленки из органического раствора компонентовЛФ.2. Гидратация липидной пленки с формированием дисперсии МСЛ.3. Фильтрация дисперсии МСЛ и получение ОСЛ приемлемого размера.4. Стерилизующаяфильтрацияидозированиелипосомальнойдисперсии.5. Лиофилизация липосомальной дисперсии.3.2.1. Получение липидной пленкиПервоначальным этапом технологического процесса приготовленияЛЛФ является получение липидной пленки. Данный этап для цифетрилина,который является гидрофобным веществом, включает операции порастворению навесок субстанции цифетрилина и липидных компонентов ворганическом растворителе, смешиванию полученных растворов и ихупаривание до образования на стенках круглодонной колбы однороднойпленки.Критическими факторами в процессе получения липидной пленкиявляются температура и уровень вакуума, обеспечивающие быстроеконцентрирование раствора липидов и образование пленки.
Оптимальнаятемпература данного процесса должна находится в пределах 37–42 °С, прикоторой не происходит увеличения индекса окисления, т.е. ПОЛ [8]. Кроме68того, необходимо учитывать, что температура формирования пленкидолжна выше Тф.п. используемого липида. Указанным требованиямотвечает ЯФХ, выбранный в качестве основного липида ЛЛФ цифетрилина.Этот природный ФЛ имеет приемлемую Тф.п. +37 °С.Уровень вакуума при получении липидной пленки должен быть всвою очередь подобран, исходя из скорости концентрирования липидов изорганического раствора [15]. Формирование на стенках колбы равномернораспределенной полупрозрачной липидной пленки с цифетрилином приотгонке органического растворителя обеспечивается при значении вакуума150–200 мбар и скорости вращения ротора 75–110 об/мин.
При болеенизкой скорости вращения раствор компонентов ЛФ «сползает» со стенокколбы и концентрируется в области дна с образованием толстой липиднойпленки. Повышение скорости вращения ротора более 110 об/мин, хотя испособствует увеличению скорости удаления органического растворителя,приводит к получению неравномерной пленки по боковой части колбы вформе «ободка».В технологии ЛЛФ на стадии получения липидной пленки чащевсего применяют легколетучие органические растворители, способныерастворять как липиды, так и большинство гидрофобных лекарственныхсубстанций. При приготовлении липосом цифетрилина используетсяхлороформ.Хлороформотноситсякрастворителям2-гоклассатоксичности (ОФС.1.1.0008.15 «Остаточные органические растворители»[2], поэтому необходимо добиться полного удаления его из липиднойпленки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
