Диссертация (1141264), страница 15
Текст из файла (страница 15)
При значениях pH от 6,86 и ниже времяудерживания примеси сокращалось, наблюдалось появление значительнойасимметрии пика, а при значениях pH более 7,3 ухудшалось разделение сдругими технологическими примесями.Существенного влияния на время удерживания и симметричностьпиков других исследуемых соединений изменения значения pH не оказывали.Наилучшего разделения всех компонентов смеси удалось добитьсяпри хроматографировании исследуемых соединений в условиях линейногоградиента двух подвижных фаз: подвижная фаза А представляла собой смесь0,015 М фосфатного буфера, доведенного до рН 7,1±0,1 с помощьюконцентрированной фосфорной кислоты и ацетонитрила в соотношении110:10 (ПФ А); подвижная фаза Б представляла собой смесь 0,015 Мфосфатного буферного раствора, доведенного до рН 7,1±0,1 с помощьюконцентрированной фосфорной кислоты и ацетонитрила в соотношении10140:80 (ПФ Б), длина волны детектирования 275 нм, скорость потокаподвижнойфазы1мл/мин.Хроматографированиепроводилисиспользованием градиента с 4 минуты определения от 0% до 100% элюента Бза 7 минут.
Схема хроматографического режима представлена в таблице 20.Колонка Thermo Scientific Hypersil BDS C18 размером 150 и ×4,6 мм, 5мкм, применявшаяся в разработанной ранее методике с изократическимрежимом элюирования в градиентном режиме показывала недостаточнуюэффективность разделения в новых условиях, вследствие этого решено былоиспользовать хроматографическую колонку с большей длиной (ThermoScientific Hypersil BDS C18 5 мкм 250 × 4,6 мм).Таблица 20Профиль градиента при анализе таблеток РУ 1205Время, минПодвижная фаза А, %Подвижная фаза Б, %047201001000000100100По окончании анализа в течение 7 мин система возвращалась кначальному составу элюентов.
Это минимальное время, необходимое дляуравновешиванияхроматографическойсистемы,посколькуприегоснижении наблюдалось изменение времени удерживания примеси 2аминобензимидазола.Пристрогомсоблюденииусловийпараметрыразделенияхроматографирования этого не наблюдалось.Втаблице21представленыосновныеисследуемых соединений при определении методом градиентной ВЭЖХ.102Таблица 21Параметры разделения, пределы обнаружения и количественногоопределения РУ 1205 и технологических примесейСоединеВремя Отн. время ЧислоФакторСтепеньПределПределниеудержива удерживан теорети- ассимет- разделения обнаруже- количественния, миния, tотнческих рии пика, соседних ния, мкгноготарелок,Qпиков, Rsопределения,Nмкг1,00РУ 1205 15,9 ± 0,02277021,160,0020,00660,60±0,02Примесь 1 9,6 ± 0,02127751,24,0 (1-2)0,0100,0330Примесь 2 11,8 ± 0,02 0,74 ± 0,02 193021,15,0 (2-3)0,0100,0330Примесь 3 13,6 ± 0,02 0,85 ± 0,04 263391,14,0 (3-4)0,0140,0462В выбранных условиях удалось добиться полного разделения РУ 1205итехнологическихпримесей(рис.30).Извлечениеизплацебо,приготовленное аналогично испытуемому раствору, оценке содержанияродственных примесей и РУ 1205 в таблетках не мешало (рис.
31). Времяудерживания пиков извлечения из плацебо составило от 2 до 4 минут,степень разделения соседних пиков (Rs) для последнего пика плацебо ипримеси 1, которая первой элюируется после плацебо, составила 11,1 (±0,5).Для приготовления модельных растворов около 0,020 г субстанцийтехнологических примесей помещали в мерную колбу вместимостью 20 мл.В колбу прибавляли около 18 мл смеси метанол – вода (1:1) и помещали вультразвуковую ванну на 15 мин, доводили до метки.
1 мл полученногораствора переносили в колбу вместимостью 10 мл, доводили до метки тем жерастворителем, перемешивали, затем 1 мл полученного раствора переносилив колбу вместимостью 10 мл, в которую предварительно отвесили около0,010 г субстанции РУ 1205 и плацебо в эквивалентном количестве.
Затемсодержимое колбы доводили до метки тем же растворителем, помещали вультразвуковую ванну на 15 мин, тщательно перемешивали и фильтроваличерез мембранный фильтр Nylon (PA) (Fisherbrand, Великобритания) сдиаметром пор 0,45 мкм. Полученный раствор подвергали анализу(концентрация РУ 1205 – 1мг/мл, концентрация технологических примесей –0,01 мг/мл).103Для приготовления растворов плацебо в мерную колбу, вместимостью10 мл отвешивали около 0,200г плацебо, прибавляли около 18 мл смесиметанол – вода (1:1) и помещали в ультразвуковую ванну на 15 мин,доводили до метки. Полученный раствор хроматографировали.Рис.
30. Типичная хроматограмма испытуемого раствора модельнойсмеси технологических примесей и РУ 1205, где 1-4 пики плацебо, 5, 6, 7 –пики примесей 1, 2 и 3 (концентрация каждого соединения 0,01 мг/мл), 8 –пик РУ 1205 (концентрация 1 мг/мл)2.29 mV123ch1123456789101112131415161718минРис. 31. Хроматограмма извлечения из плацебоЛинейная зависимость площади пика от концентрации РУ 1205 вусловиях градиента была подтверждена в пределах интервала от 0,001 до 0,1мг/мл, примесей 1, 2 и 3 – от 0,005 до 0,06 мг/мл, коэффициенты корреляцииболее 0,998.
(рис. 32)104y = 647,79x + 0,1489R² = 1y = 543,52x + 0,0148R² = 0,9986y = 229,21x + 0,079R² = 0,9996Примесь 1Примесь 2y = 229,21x + 0,079R² = 0,9996y = 219,25x + 0,0076R² = 0,9997Примесь 3РУ-1205Рис. 32. Зависимость площади пика от концентрации РУ 1205 итехнологических примесейПредел обнаружения РУ 1205 был определен экспериментально изсоотношения сигнал/шум (3:1) и составил около 0,002 мкг, примеси 1 – около0,01 мкг, примеси 2 – около 0,01 мкг, примеси 3 – около 0,014 мкг.Предел количественного определения РУ 1205 был определен попределу обнаружения, умноженному на коэффициент 3,3, и составил – 0,0066мкг, примеси 1 – 0,033 мкг, примеси 2 – 0,033 мкг, примеси 3 – 0,0462 мкг.На модельных смесях технологических примесей и плацебо былапроведена оценка правильности и сходимости методики.Для приготовления модельных смесей около 0,010 г (0,020 г или 0,030г, точная навеска) субстанций технологических примесей помещали вмерную колбу вместимостью 100 мл.
В колбу прибавляли около 18 мл смесиметанол – вода (1:1) и помещали в ультразвуковую ванну на 15 мин. Затемсодержимое колбы доводили до метки тем же растворителем, тщательноперемешивали и фильтровали через мембранный фильтр Nylon (PA)(Fisherbrand, Великобритания) с диаметром пор 0,45 мкм. 1 мл полученногораствора переносили в колбу вместимостью 20 мл, куда предварительноотвесили 0,2 г плацебо, доводили до метки тем же растворителем,перемешивали.105Количественное определение примесей было проведено с применениемпоправочных коэффициентов, рассчитанных по формуле:где Сх, Сст – концентрации примеси и РСО (РУ 1205) соответственно,в мг/мл; Sх, Sст – площади пиков примеси и РСО (РУ 1205) соответственно, вединицах интегратора.Поправочные коэффициенты были определены экспериментально, намодельных растворах технологических примесей и составили 1,031 дляпримеси 1; 2,248 для примеси 2 и 2,426 для примеси 3.Оценку сходимости методики проводили, используя следующиерасчетные критерии: средние значения измерений (Хср), стандартныеотклонения(S),относительныестандартныеотклонения(RSD)идоверительные интервалы (ΔX).Результаты определения правильности и сходимости методики намодельных смесях представлены в таблице 22.Таблица 22Результаты оценки содержания технологических примесей вмодельных смесяхПримесь 1Примесь 2Примесь 3Взято (C1), Найдено Взято (C1), Найдено Взято (C1), Найденомг/мл(в % от C1)мг/мл(в % от C1)мг/мл(в % от C1)0,015000,010000,00505100,99101,00100,9995,0096,5397,00100,66102,66104,330,014900,009950,00490102,9499,00104,995,9795,00102,00102,33100,00103,330,015000,010000,0051095,9193,8798,9793,4696,4897,4898,3296,9798,32106Метрологические характеристики (P=95%, n=9)Хср±ΔX = 99,91±2,42(%)S = 3,07; RSD = 3,07%ε = 2,42%tвыч = 0,09; tтабл = 2,36Хср±ΔX = 100,61±2,67(%)S = 3,39; RSD = 3,37%ε = 2,60%tвыч = 0,54, tтабл = 2,36Хср±ΔX = 96,64±1,47(%)S = 1,94; RSD = 2,00%ε = 1,52%tвыч = 5,20, tтабл = 2,36δ = 3,36Полученные результаты не отягощены систематической ошибкой исвидетельствуютобудовлетворительнойправильностиопределенияпримесей 1 и 2 с помощью разработанной методики: доверительныйинтервал среднего значения для примесей 1 и 2 включает значение 100%,значения вычисленного коэффициента Стьюдента (tвыч) не превышаюттабличные(tтабл).систематическойВслучаеошибки(δ),определениявероятно,примесиобъясняется3ееналичиенеполнымизвлечением из модельной смеси с плацебо, но значение этой ошибкиневелико и не превышает 3,5%.Сходимость методики подтверждается значениями доверительногоинтервала (ΔX, для всех примесей не превышают 2,7%), а также значениямиотносительного стандартного отклонения (RSD, для всех примесей непревышают 3,5%, что является приемлемым для определения примесей)[Береговых В.
В. и др., 2008].Дляпроверкипригодностихроматографическойсистемыбылприготовлен раствор РСО РУ 1205 и примеси 1 с концентрацией каждогосоединения 0,01 мг/мл. Для этого около 0,020 г субстанции РУ 1205, 0,020 гпримеси 1 и 0,020 г примеси 3 (точные навески) помещали в мерную колбувместимостью 20 мл и растворяли в достаточном объеме смеси метанол вода (1:1), тщательно перемешивали (раствор А, концентрация РУ 1205 ипримесей – 1мг/мл).1 мл раствора А переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл,доводили до метки тем же растворителем, тщательно перемешивали ихроматографировали не менее 5 раз (раствор для определения пригодности107хроматографической системы, концентрация РУ 1205 и примесей – 0,01мг/мл).Оценку пригодности хроматографической системы проводили последующим критериям: относительное стандартное отклонение результатовотдельных измерений площадей пика РУ 1205 (RSD), число теоретическихтарелок (N), коэффициент ассиметрии пика РУ 1205 (Q), разрешениепримеси 1 (относительно РУ 1205) в растворе для проверки пригодностихроматографической системы (Rs1) и разрешение примеси 3 (относительноРУ 1205 (Rs3)).
Результаты представлены в таблице 23.Таблица 23Параметры и критерии пригодности хроматографической системыРезультаты определения параметров пригодности хроматографическойсистемы (среднее ± доверительный интервал)NQRs1Rs3RSD1,16 ± 0,0326,6 ± 0,212,0 ± 0,31,55 ± 0,2 %27702 183Критерии приемлемостиНе менее 25000 Не более 1,227 ± 0,312,0 ± 0,3Не более 2%На основании полученных данных были установлены следующиекритерии пригодности хроматографической системы: число теоретическихтарелок – не менее 25000; фактор асимметрии пика РУ 1205 – не более 1,2;разрешение между примесью 1 и РУ 1205 – 26,6 ± 0,2, примесью 3 и РУ 1205– 12,0 ± 0,3 и относительное стандартное отклонение результатов отдельныхизмерений площадей пика РУ 1205 – не более 2%.ПриоформлениихроматографическойпроектасистемыНДнамидлябылаопределениявыбранапригодностипримесь1(2-аминобензимидазол (Aldrich Cat.
№934-32-7)), т.к. она присутствует вкаталогах в качестве аналитического стандарта.С применением разработанных условий было проведена оценкасодержания родственных примесей в серийных образцах таблеток РУ 1205,покрытых пленочной оболочкой.108Приготовление испытуемых растворов для определения содержанияпримесей в образцах таблеток проводили следующим образом: около 0,420 г(точная навеска) массы растертых таблеток РУ 1205 переносили в мернуюколбу вместимостью 20 мл, прибавляли около 18 мл смеси метанол - вода(1:1) и помещали в ультразвуковую ванну на 15 мин. Затем содержимоеколбы доводили до метки тем же растворителем, перемешивали ифильтроваличерезмембранныйфильтрNylon(PA)(Fisherbrand,Великобритания) с диаметром пор 0,45 мкм (испытуемый раствор,концентрация РУ 1205 – 1 мг/мл).В качестве раствора РСО использовали раствор субстанции РУ 1205 всмеси метанол - вода (1:1) с концентрацией РУ 1205 0,01 мг/мл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
