Диссертация (1141264), страница 11
Текст из файла (страница 11)
20).350300y = 6347,2x + 0,652R² = 0,9999250200y = 2295,3x + 0,0624R² = 0,9999150y = 4773,5x + 0,2195R² = 1100y = 2137,7x + 0,7438R² = 0,998650000,01РУ 12050,02Примесь 10,030,04Примесь 20,050,06Примесь 3Рис. 20. Зависимость площадей пиков от концентрации растворов РУ1205 и вероятных технологических примесейПредел обнаружения для РУ 1205 составил около 0,0008 мкг (0,00004мг/мл), примеси 1 – около 0,0016 мкг (0,00008 мг/мл), примеси 2 – около680,002 мкг (0,0001 мг/мл), примеси 3 – около 0,0012 мкг (0,00006 мг/мл) (табл.4).На основании полученных результатов можно сделать предположение,что рабочая концентрация раствора субстанции РУ 1205 для анализародственных примесей должна составлять от 0,5 до 1 мг/мл. Такаяконцентрация позволит обнаружить технологические примеси в субстанции всодержании 0,02% и даже менее. Для проведения дальнейших исследованийвыбрана концентрация испытуемого раствора 1 мг/мл.Дляпроверкипригодностихроматографическойсистемыбылприготовлен раствор стандартного образца РУ 1205 и 2-аминобензимидазола(примеси 1) (Aldrich кат.
№ 934-32-7) в подвижной фазе с концентрациейвыбранных соединений 0,01 мг/мл.Пригодностьоценивать похроматографической5 хроматограммамсистемыбылопредложеноданного раствора по следующимпараметрам: величина относительного стандартного отклонения (RSD)площадей пиков РУ 1205; число теоретических тарелок (N); факторасимметрии (Q); степень разрешения пиков примеси 1 и РУ 1205 (Rs)(согласно ОФС 1.2.1.2.0001.15) [ГФ XIII, 2016].Эффективность хроматографической колонки оценивали по числутеоретических тарелок, рассчитанных по пику РУ 1205 по следующейформуле:2lRN = 5,545 x ------W0,5,где lR – время удерживания основного пика, в минутах; W0,5 – ширинапика на половине высоты, в минутах.Фактор асимметрии пика РУ 1205 был определен по следующей формуле:69где: W0,05 – ширина пика на высоте 5% от базовой линии, в минутах; f– расстояние от начала пика на высоте 5% от базовой линии доперпендикуляра, проведенного из его вершины, в минутах.Разрешение пиков РУ 1205 и примеси 1 рассчитывали по формуле:tR2 - tR1(Wb1 + Wb2)/2где: tR2 - tR1 – расстояние между максимумами выбранных соседнихRs =пиков, в минутах; (Wb1 + Wb2)/2 – полусумма их ширин у основания, вминутах.В таблице 8 представлены результаты определения пригодностихроматографической системы и критерии приемлемости, выбранные наосновании полученных экспериментальных результатов.Таблица 8Результаты определения пригодности хроматографической системы икритерии приемлемостиЗначения параметров пригодности ± отклоненияRsQNRSD,%15,0 ± 0,201,0 ± 0,17484 ± 12380,70 ± 0,13Критерии приемлемостиНе более 15,0± 0,50Не более 1,5Не менее 7000Не более 1,0%На основании полученных данных были установлены следующиекритерии пригодности хроматографической системы: число теоретическихтарелок – не менее 7000; коэффициент асимметрии пика РУ 1205 – не более1,5; разрешение пика примеси 1 и пика РУ 1205 – 15,0 ± 0,20 и относительноестандартное отклонение результатов площадей пика РУ 1205 – не более 1%.Как видно на рис.
12, отклик детектора для РУ 1205 и свидетелейтехнологических примесей отличался, поэтому расчет содержания этихпримесей в субстанции было решено проводить с применением поправочныхкоэффициентов.70Поправочные коэффициенты рассчитывали для модельных смесей РУ1205 и технологических примесей трех концентраций (0,01мг/мл, 0,005 мг/мли 0,002 мг/мл) по формуле:стстгде Сх, Сст - концентрации примеси и стандарта (РУ 1205), в мг/мл;Sх, Sст – площади пиков примеси и стандарта (РУ 1205) в единицахинтегратора.Результаты представлены в таблице 9.Таблица 9Результаты определения поправочных коэффициентов длятехнологических примесей РУ 1205НаименованиеКонцентрация, мг/млсоединения0,002 мг/мл 0,005 мг/мл0,01 мг/млПоправочные коэффициенты(усредненные, n=5)Примесь 11,391,381,41Примесь 22,902,922,98Примесь 33,123,062,95Среднеезначениекоэффициента1,392,933,04В результате проведенных исследований была разработана методикаопределения родственных примесей в субстанции РУ 1205, представленнаяниже.Приготовление испытуемого раствора: 0,025 г (точная навеска)субстанции помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 15мл подвижной фазы, доводят объем раствора до метки тем же растворителеми перемешивают (концентрация испытуемого раствора – 1 мг/мл).Приготовление раствора рабочего стандартного образца (РСО): около0,025 г (точная навеска) рабочего стандартного образца (РСО) РУ 1205помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 15 млподвижной фазы, доводят объем раствора до метки тем же растворителем иперемешивают (концентрация раствор 1 РСО – 1 мг/мл).
1 мл раствора 1 РСОпомещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора до71метки подвижной фазой и перемешивают (концентрация раствора 2 РСО –0,01 мг/мл).Приготовлениерастворадляпроверкипригодностихроматографической системы: около 0,020 г РУ 1205 и 0,020 2аминобензимидазола (примеси 1) (Aldrich кат. № 934-32-7) (точные навески)помещают в мерную колбу вместимостью 20 мл и растворяют в достаточномобъеме смеси метанол –вода в объемном соотношении 1:1, тщательноперемешивают (раствор А, концентрация РУ 1205 и 2-аминобензимидазола –по 1 мг/мл).1 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл,доводят до метки тем же растворителем, тщательно перемешивают (раствордля проверки пригодности хроматографической системы, концентрация РУ1205 и 2-аминобензимидазола – 0,01 мг/мл).Перед проведением анализа колонку уравновешивают подвижнойфазой до достижения стабильной базовой линии, проводили холостой опыт.Хроматографируютраствордляпроверкипригодностихроматографической системы, испытуемый раствор, раствор РСО, получаяне менее 5 хроматограмм каждого из растворов.Хроматографическую систему считают пригодной, если выполняютсятребования, представленные в таблице 8.Всерастворыследуетиспользоватьнепосредственнопослеприготовления.Формула расчета содержания единичной примеси (Х, %) следующая:где Sпр – площадь пика индивидуальной примеси;Sст – площадь пика РУ 1205 на хроматограмме раствора РСО;72mст – масса навески РСО РУ 1205, г;mисп – масса навески образца субстанции РУ 1205, г;W – чистота РСО РУ 1205, %;Zисп – потеря в массе образца субстанции РУ 1205, %;Zст – потеря в массе СО РУ 1205, %.В качестве РСО РУ 1205 использовался серийный образец субстанции,паспорт на который представлен в приложении 1.Разработаннаяметодикабылавалидированапопоказателям:специфичность, линейность и диапазон применения, предел обнаружения,предел количественного определения, правильность и прецизионность.Специфичность методики подтверждается разделением РУ 1205 и еготехнологических примесей в модельных смесях (см.
рис. 10).Также для дополнительного подтверждения специфичности методикиобразцы, приготовленные для определения родственных примесей, былипомещены под действие солнечного света. Через 8 суток в пробах былобнаружен ряд дополнительных примесей, полностью разделившихся сосновным веществом (РУ 1205) (см.
рис. 21). Обнаруженные в пробахпримеси идентифицированы не были.735.1 8 mV6212047101381239111419151626232217 18242527ch1246810121416182022242628303234363840424446минРис. 21. Хроматограмма раствора РУ 1205 в подвижной фазе,подвергшегося действию солнечного света в течение 8 суток (времяудерживания РУ 1205 около 13 мин)Пределы обнаружения и количественного определения для РУ 1205 итехнологических примесей представлены в табл. 7.Линейная зависимость площади пика от концентрации РУ 1205подтверждена в диапазоне концентраций от 0,001 до 0,05 мг/мл, примеси 3 –от 0,0002 до 0,01, примеси 2 – от 0,0004 до 0,05 мг/мл, примеси 1 – от 0,0003до 0,04 мг/мл (см.
рис. 20).Правильность и прецизионность методики были подтверждены сиспользованиемпоправочныхкоэффициентовнамодельныхсмесяхсубстанции РУ 1205 и технологических примесей (примесей 1, 2 и 3) сизвестным содержанием всех соединений.Концентрация РУ 1205 в модельных растворах составила около 1мг/мл, а концентрация примесей – 0,002 мг/мл, 0,005 мг/мл и 0,01 мг/мл,соответственно.Модельные смеси готовили следующим образом: около 0,050 г (точнаянавеска) каждой технологической примеси помещали в мерную колбувместимостью 50 мл, добавляли 40 мл подвижной фазы, тщательноперемешивали, доводили до метки тем же растворителем и перемешивали(концентрация раствора А – 1 мг/мл).74Около 0,1 г (точная навеска) субстанции РУ 1205 помещали в мернуюколбу вместимостью 100 мл, растворяли в 50 мл подвижной фазы,прибавляли 1 мл раствора А технологических примесей, доводили объемраствора до метки подвижной фазой и перемешивали (раствор В,концентрация примесей 0,01 мг/мл, концентрация РУ 1205 – 1 мг/мл).Для получения модельных смесей с концентрациями технологическихпримесей 0,005 мг/мл и 0,002 мг/мл в мерную колбу вместимостью 50 млпомещали навески по 0,025 и 0,010 г каждой примеси соответственно.Последующее разведение проводилось по описанной выше методике.В качестве раствора РСО использовали раствор серийного образцасубстанции РУ 1205 (приложение 1) с концентраций 0,01 мг/мл.Около 0,025 г (точная навеска) субстанции РУ 1205 помещали вмерную колбу вместимостью 25 мл, добавляли 20 мл подвижной фазы,тщательно перемешивали, доводили объем раствора до метки тем жерастворителем и вновь перемешивали (раствор РСО 1 – концентрация 1мг/мл).1 мл раствора РСО 1 помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл,доводили объем раствора до метки подвижной фазой и перемешивали(раствор РСО 2 – концентрация РУ 1205 - 0,01 мг/мл).Результаты оценки содержания примесей 1, 2 и 3 в модельных смесях ссубстанцией РУ 1205 с использованием коэффициентов представлены втаблице 10.75Таблица 10Результаты оценки содержания технологических примесей РУ 1205 вмодельных смесях№п/пЗаданнаяОбнаруженоконцентрацияпримеси,примеси, мг/млмг/млОбнаруженопримеси(в % от заданнойконцентрации)Примесь 1Метрологическиехарактеристики, (Р=95%, n=3)Хср = 102,02S = 1,57ΔХср = 3,90ε = 3,47%RSD = 1,54% tвыч = 2,23tтабл = 4,30tвыч < tтабл10,010200,0101899,8020,005100,00517101,3730,002040,00210102,94Примесь 210,010100,01017100,6920,005050,00514101,7830,002020,00205101,49Примесь 310,010450,01051100,57230,005230,002090,005390,00214103,04102,39ПорезультатаманализаХср = 101,32S = 0,56ΔХср = 1,39ε = 1,37%RSD = 0,55%tвыч = 4,08tтабл = 4,30tвыч < tтаблХср = 102,00S = 1,28ΔХср = 3,18ε = 3,12%RSD = 1,25%tвыч = 2,71tтабл = 4,30tвыч < tтаблмодельныхсмесейустановлено,чтоотклонение среднего результата определения от истинного значения для всехпримесей не превышало 3,1%.Для оценки прецизионности (сходимости) результатов рассчитываликоэффициент вариации (RSD), который для всех примесей не превышал 2% ифактически составлял менее 1,6%.Проверка результатов с помощью t-критерия не выявила присутствиесистематической ошибки: значения вычисленного критерия Стьюдента непревышали табличных значений: 2,23 < 4,30 (примесь 1); 4,08 < 4,30(примесь 2) и 2,71 < 4,30 (примесь 3).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
