Диссертация (1141264), страница 14
Текст из файла (страница 14)
4.6).4.5. Определение родственных примесей методом ВЭЖХВ субстанции РУ 1205 возможно присутствие технологическихпримесей: 2-аминобензимидазола, 2-амино-1-морфолиноэтилбензимидазола93и бромида 2-амино-1-морфолиноэтил-3-(4-фторфенацил)бензимидазолия, атакже ряда других неидентифицированных примесей (см. главу 3).
Влекарственной форме РУ 1205 также могут содержаться примеси,присутствующие в субстанции. Определение показателя «Родственныепримеси» таблеток РУ 1205 было проведено методом высокоэффективнойжидкостной хроматографии.4.5.1.Высокоэффективнаяжидкостнаяхроматографиявизократическом режиме элюированияАнализ серийных образцов таблеток РУ 1205 был проведен в условиях,аналогичных условиям анализа субстанции РУ 1205, методом ВЭЖХ визократическом режиме элюирования (см.
главу 3, п. 3.3.).В указанных условиях происходит полное разделение РУ 1205 и еготехнологических примесей (рис. 27).21 mV34625178 9 1012 1311ch1246810121416182022242628303234минРис. 27. Хроматограмма модельной смеси извлечения из таблеток РУ1205 и технологических примесей РУ 1205 (концентрация РУ 1205 – 1 мг/мл,концентрация примесей – 0,01 мг/мл): 1 и 2 – пики плацебо; 3 – примесь 1; 4– примесь 2; 6 – примесь 3На рисунках 28 и 29 представлены типичные хроматограммыизвлечений из таблеток РУ 1205, покрытых пленочной оболочкой, смесьюметанол – вода (1:1) (концентрация РУ 1205 – 1 мг/мл) и плацебо,приготовленное аналогично испытуемому раствору.942.6 2 mV2154315 6 7 8 9 10111213161421171819ch12468101214161820222426283032343638 20404244464850525456минРис.
28. Типичная хроматограмма извлечения из таблеток РУ 1205(серия 402013), покрытых пленочной оболочкой(концентрация РУ 1205 1 мг/мл)Рис. 29. Хроматограмма извлечения из плацебо в концентрацииэквивалентной концентрации испытуемого раствора с концентрацией РУ1205 1мг/млИсходя из полученных данных, можно предположить, что компонентыплацебо, время удерживания которых близко ко времени удерживанияпримеси 1, могут мешать количественному определению примеси 1,поскольку их пики могут перекрываться. Поскольку площадь пиковкомпонентов плацебо невелика, их влияние на результаты количественногоопределения примеси 1 будет зависеть от концентрации примеси 1 в пробе.Для того чтобы оценить содержание примеси 1 в пробе, при которомвлияние пиков плацебо на результаты анализа будут незначительными, были95приготовлены модельные смеси, содержащих плацебо и РУ 1205 всоотношении идентичном их соотношению в таблетках (концентрация РУ1205 – 1 мг/мл), с добавлением технологических примесей в содержании0,1%, 0,2% и 0,5% от содержания РУ 1205 (концентрации 0,001 мг/мл, 0,002мг/мл, 0,005 мг/мл).Расчет содержания технологических примесей в модельных смесяхпроведен с использованием коэффициентов, полученных при анализесубстанции РУ 1205.Модельные смеси с плацебо готовили следующим образом: около 0,010г (точная навеска) примесей 1, 2 и 3 помещали в мерную колбувместимостью 10 мл, растворяли в достаточном количестве смеси метанол вода (1:1).
1 мл полученного раствора переносили в мерную колбу,вместимостью 100 мл, доводили до метки тем же растворителем и тщательноперемешивали (раствор А, концентрация – 0,01 мг/мл).1 мл (2 мл или 5 мл) раствора А, переносили в мерную колбу на 10 мл,в которую предварительно отвешивали около 0,010 г (точная навеска) РУ1205 и 0,2 г (точная навеска) плацебо, растворяли в достаточном объемесмеси метанол – вода (1:1), тщательно перемешивали.
Полученный растворпомещали в ультразвуковую ванну на 30 мин, затем фильтровали черезмембранный фильтр Nylon (PA) (Fisherbrand, Великобритания) с диаметромпор 0,45 мкм и хроматографировали (полученный раствор с концентрациейРУ 1205 – 1 мг/мл, примесей 1, 2, 3 – 0,001 мг/мл (0,002 мг/мл или 0,005мг/мл)).Результаты количественного определения примесей в модельныхсмесях представлены в таблице 18.96Таблица 18Результаты определения содержания технологических примесей вмодельных смесях плацебо, РУ 1205 и примесей№Взято(C1),мг/млНайдено(в % отC1)Абс.ошибкаОтн.ошибка,%Метрологическиехарактеристики (P=95%,n=3)114,82+0,00014+ 14,82102,53+0,00002+ 2,5399,80-0,00001- 0,20105,94+0,00011+ 5,940,00202100,15+0,000003+ 0,150,0050599,6998,0297,65100,11-0,00001-0,00010-0,00012+0,000002- 0,31- 1,98- 2,35+ 0,11Хср±ΔX =105,64±19,86%S = 8,00; RSD = 7,57ε = 18,79%tвыч = 1,22; tтабл = 4,30Хср±ΔX =101,92±8,63%S = 3,48; RSD = 3,41ε = 8,46tвыч = 0,95; tтабл = 4,300,00102108,82103,4598,96+0,00008+0,00003-0,00002+ 8,82+ 3,45- 1,040,00204101,9699,5897,25+0,00003-0,00001-0,00006+ 1,96- 0,42- 2,7597,0698,52100,10-0,00015-0,00008+0,000005- 2,94- 1,48+ 0,100,0010592,3896,5498,45-0,00009-0,00004-0,00002- 7,62- 3,46- 1,550,0020997,6099,80100,18-0,00005-0,00001+0,000002- 2,40- 0,20+ 0,1896,1897,8598,37-0,00020-0,00012-0,00009- 3,82- 2,15- 1,63Примесь 2Примесь 10,00101Примесь 30,005100,00523Хср±ΔX =98,59±3,27%S = 1,32; RSD = 1,34ε = 8,75tвыч = 1,85; tтабл = 4,30Хср±ΔX =103,74±12,23%S = 4,93; RSD = 4,75ε = 11,78tвыч = 1,31;tтабл = 4,30Хср±ΔX =99,59±5,83%S = 2,35; RSD = 2,35ε = 5,85tвыч = 0,30;tтабл = 4,30Хср±ΔX =98,56±3,77%S = 1,52; RSD = 1,54ε = 3,82tвыч = 1,64; tтабл = 4,30Хср±ΔX =95,79±7,69%S = 3,10; RSD = 3,23ε = 8,03tвыч = 2,35;tтабл = 4,30Хср±ΔX =99,19±3,45%S = 1,39; RSD = 1,40ε = 3,47tвыч = 1,00; tтабл = 4,30Хср±ΔX =97,46±2,83%S = 1,14; RSD = 1,16ε = 2,90tвыч = 3,85; tтабл = 4,30Метрологическиехарактеристики(P=95%, n=9)Хср =102,08%ΔX = 4,24%S = 5,39;RSD = 5,28%ε = 4,15%tвыч = 1,16tтабл = 2,36Хср =100,63%ΔX = 2,91%S = 3,70;RSD = 3,67%ε = 2,89%tвыч = 0,51tтабл = 2,36Хср = 97,48%ΔX = 1,83%S = 2,32;RSD = 2,38%ε = 1,87%tвыч = 3,25tтабл = 2,36δ = 2,52Поскольку вычисленный коэффициент Стьюдента (tвыч) не превышаеттабличные значения (tтабл) при определении примесей 1 и 2, полученныерезультаты не отягощены систематической ошибкой, что свидетельствует обудовлетворительной правильности разработанной методики.97Систематическая ошибка (δ = 2,52) при определения примеси 3,вероятно, связана с ее неполным извлечением из модельной смеси с плацебо.Сходимость методики характеризуется значениями доверительногоинтервала (ΔX, для всех примесей не превышают 4,3%) и значениямиотносительного стандартного отклонения (RSD, для всех примесей непревышают 5,3%).Исходя из значений площадей пика плацебо и примеси 1, рассчитано,что вклад площади пика плацебо в площадь пика примеси 1 при еесодержании в пробе около 0,2% будет составлять около 10%, и со снижениемконцентрации примеси 1 будет увеличиваться.
Согласно экспериментальнымданным, представленным в таблице 18, относительная ошибка определенияпримеси 1 в концентрации 0,001 мг/мл составила почти 19%.С помощью описанной выше методики проведено определениесодержания родственных примесей в таблетках РУ 1205 серий 20213, 30213,40213, 50213, 60213.В расчет принимались пики со временем удерживания 1,5 и более (и сотносительным временем удерживания (относительно РУ 1205) 0,12 и более),поскольку до этого времени элюируются только компоненты плацебо.Для приготовления испытуемого раствора около 0,210 г (точнаянавеска) массы растертых таблеток РУ 1205 переносили в мерную колбувместимостью 10 мл, прибавляли около 8 мл смеси метанол - вода дляградиентной ВЭЖХ (1:1) и помещали в ультразвуковую ванну на 15 мин.Затем содержимое колбы доводили до метки тем же растворителем,перемешивали и фильтровали через мембранный фильтр Nylon (PA)(Fisherbrand, Великобритания) с диаметром пор 0,45 мкм (испытуемыйраствор, концентрация РУ 1205 – 1 мг/мл).Для приготовления раствора рабочего стандартного образца (РСО)около 0,025 г (точная навеска) субстанции РУ 1205 помещали в мернуюколбу вместимостью 25,0 мл, растворяли в достаточном объеме смеси98метанол - вода (1:1), доводили объем раствора тем же растворителем дометки и перемешивали (раствор 1 РСО, концентрация 1 мг/мл).1 мл полученного раствора 1 РСО помещали в колбу вместимостью 100мл, растворяли в достаточном объеме смеси метанол - вода (1:1), доводилиобъем раствора тем же растворителем до метки и перемешивали (Раствор 2РСО, концентрация 0,01 мг/мл).Приготовлениерастворадляпроверкипригодностихроматографической системы проводили так же, как и при определенииродственных примесей в субстанции.Перед проведением анализа колонку уравновешивали подвижнойфазой до достижения стабильной базовой линии, проводили холостой опыт.Регистрировали не менее 5 хроматограмм испытуемого раствора и неменее 5 хроматограмм раствора РСО.Формула расчета содержания единичной примеси (Х, %) следующая:навнавгде Sпр – площадь пика индивидуальной примеси;Sст – площадь пика РУ 1205 на хроматограмме раствора РСО;mст – масса навески РСО РУ 1205, г;mнав – масса навески таблеточной массы, г;mср – средняя масса таблетки РУ 1205, г;С – содержание РУ 1205 в одной таблетке, г;W – количественное содержание РУ 1205 в РСО, %;Zст – потеря в массе РСО РУ 1205, %.Результаты количественного определения родственных примесейпредставлены в таблице 19.99Таблица 19Результаты определения родственных примесей в таблетках РУ 1205Относительное времяудерживания0,15 ± 0,010,18 ± 0,010,22 ± 0,010,26 ± 0,020,29 ± 0,010,38 ± 0,010,43 ± 0,020,46 ± 0,030,56 ± 0,010,60 ± 0,020,64 ± 0,020,68 ± 0,020,83 ± 0,021,34 ± 0,031,40 ± 0,053,61 ± 0,08Сумма примесей, %ОтносительныеСодержание родственных примесей, %20213302134021350213602130,040,050,040,050,040,060,070,070,080,060,010,010,030,020,030,020,020,010,010,010,010,010,010,010,010,010,010,010,010,010,010,010,010,010,020,010,020,020,020,030,020,030,020,010,020,010,010,010,010,010,010,010,010,010,010,010,010,010,010,030,020,040,010,240,230,230,230,230,040,040,040,040,030,180,220,220,210,170,680,800,740,810,66временаудерживаниятрехизобнаруженныхпримесей так же, как и в субстанции, совпадали с относительнымивременами удерживания примесей 1, 2 и 3, однако так же, как и всубстанции, провести однозначную идентификацию этих примесей методомдобавок не удалось из-за их незначительного содержания в пробах.Содержание единичной примеси в образцах таблеток не превышало0,24%, а сумма примесей не превышала 0,81% [Илларионов А.
А. и др, 2014].Поскольку было показано, что компоненты плацебо мешаютопределению в образцах таблеток РУ 1205 примеси 1, нами былапредпринята попытка полностью разделить пики компонентов плацебо итехнологических примесей. В изократическом режиме элюирования выбратьусловия, позволяющие это сделать, нам не удалось, поэтому дальнейшиеисследованияэлюирования.проводилисьсприменениемградиентногорежима1004.5.2.Высокоэффективнаяжидкостнаяхроматографиявградиентном режиме элюированияДля того чтобы полностью избежать влияния пиков плацебо нарезультаты количественного определения примесей, было принято решениеразработать методику разделения технологических примесей РУ 1205 врежиме градиентной ВЭЖХ.При разработке методики в качестве основного компонента слабогоэлюента использовали 0,015 М растворы калия гидрофосфата с pH от 6,5 до7,5 в различных соотношениях с ацетонитрилом, а в качестве сильногоэлюента - смеси ацетонитрила, метанола и 0,015 М раствора калиягидрофосфата с pH от 6,5 до 7,5.Наличие метанола в смеси приводило к выраженной асимметрии пикаРУ 1205 и его технологических примесей, поэтому в дальнейшихисследованиях от него, как компонента подвижной фазы, было решеноотказаться.Выбор pH буферного раствора был определен формой пика ивременем удерживания примеси 1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
