Диссертация (1141264), страница 10
Текст из файла (страница 10)
В дальнейшем наблюдались незначительные колебанияэтих значений, вероятно, связанные с изменением атмосферной влажности,либо с погрешностью измерений. Потеря в массе образцов субстанции,определенная после завершения эксперимента (через 30 дней), составляла от12,67 до 13,10%.Также нами было показано, что при хранении образцов субстанции РУ1205 в естественных условиях в полимерных банках с закрытыминавинчивающимися крышками также наблюдается увеличение потери вмассе при высушивании субстанции, связанное с поглощением атмосфернойвлаги. В среднем значения потери в массе при высушивании образцов,хранившихся в естественных условиях месяц и более, составляет от 10,5 до13% при изначальном содержании в них влаги (непосредственно послевыпуска) от 5 до 10%.В таблице 4 приведены результаты определения внешнего вида,растворимости, прозрачности, цветности, pH и потери в массе привысушивании.Таблица 4Внешний вид, растворимость, прозрачность, цветность, pH растворов ипотеря в массе при высушивании серийных образцов субстанции РУ 1205Показатель качества1-013Внешний видНомер образца58217214Почти белый кристаллический порошок82857Продолжение таблицы 4Растворимость- в воде- в спирте- в смеси спирт-вода (1:1)- в кислоте муравьиной- в ацетоне- в диметилформамиде- в хлороформе- в гексанеПрозрачностьЦветность1: 1801: 3601: 921: 4Менее чем1: 10000Менее чем1: 10000Менее чем1: 10000Менее чем1: 10000ПрозрачныйБесцветныйpH (водный раствор с3,15концентрацией 0,25%)Потеря в массе, % (130 оС) 5,601: 2201: 6201: 771: 5Менее чем1: 10000Менее чем1: 10000Менее чем1: 10000Менее чем1: 10000Менееэталона IБесцветный1: 1901: 8001: 1101: 6Менее чем1: 10000Менее чем1: 10000Менее чем1: 10000Менее чем1: 10000ПрозрачныйБесцветный1: 1901: 8001: 1001: 6Менее чем1: 10000Менее чем1: 10000Менее чем1: 10000Менее чем1: 10000ПрозрачныйБесцветный1: 1501: 3701: 1101: 4Менее чем1: 10000Менее чем1: 10000Менее чем1: 10000Менее чем1: 10000ПрозрачныйБесцветный2,952,992,963,006,115,486,694,853.2.
Определение спектральных характеристик субстанции РУ 12053.2.1. УФ-спектроскопияУФ-спектры РУ 1205 были получены для растворов субстанций сконцентрацией 0,01 мг/мл в воде.В УФ-спектрах растворов всех образцов субстанции в воде в диапазонедлин волн от 200 до 300 нм присутствовали два максимума поглощения при242±2 нм и 271±2 нм и два минимума при 225±2 и 255±2 нм (рис. 11).Рис. 11 УФ-спектр раствора субстанции РУ 1205 в воде (концентрация0,01 мг/мл)58Втаблице5представленызначениямолярногоиудельногопоказателей поглощения растворов РУ 1205, определенные при максимумахи минимумах его спектра.Таблица 5Удельные и молярные показатели поглощения растворов РУ 1205λmax, нм242±2271±2λmin, нм225±2255±2ε2186724053ε1661917056Е1см1%500550Е1см1%3803903.2.2.
ИК-спектроскопияИК-спектры образцов субстанций РУ 1205 были получены в таблетках(дисках) калия бромида (спектры поглощения) и методом НПВО.Поскольку субстанция гигроскопична, в ее ИК-спектрах наблюдаласьвыраженная полоса поглощения адсорбционной воды (3430 см-1 колебания –OH групп, участвующих в водородной связи), интенсивность которойзависела от содержания воды в субстанции и значительно отличалась вспектрах различных образцов субстанции.На ИК-спектрах РУ 1205 в таблетках калия бромида широкая иинтенсивная полоса поглощения при 3430-3440 см-1 присутствовала дажепосле предварительного высушивания образца субстанции до постоянноймассы, что, вероятно, объясняется быстрым поглощением атмосферной влагив процессе приготовления пробы (рис. 12а).На ИК-спектрах НПВО высушенной до постоянной массы субстанцииРУ 1205 эта полоса поглощения была значительно менее интенсивной (рис.13а).В диапазоне от 400 до 3000 см-1 спектры всех образцов субстанцииимели характеристические полосы при: 1620, 1602 и 1508 см-1, (С=С связиароматическогокольца),1660см-1(валентныеколебанияС=Nгетероциклического фрагмента), 2434-2600 см-1 (колебания связи RN+H359фрагментовморфолинаиимидазобензимидазола)исм-1,1237(монофторзамещенное ароматическое кольцо (ArC-F)) (рис.
12б, 13б).1600140012001000Wavenumber cm-1800600397.00517.86494.34477.67459.64432.34571.00605.45642.61749.02723.69700.45940.56908.26883.23865.89843.72814.131066.971051.641018.88986.831102.821166.371136.171202.971308.741293.071267.831237.861397.831508.631481.081620.821602.061660.916570Transmittance [%]7580859095Рис. 12а400Рис. 12б.01/12/2011Рис. 12. ИК-спектры субстанции РУ 1205 (KBr) в области от 400до-1-14000 см (12а) и от 400Pageдо1/12000 см (12б)C:\Data\Sample 111201.7Sample 11120160Рис. 13аРис. 13бРис. 13 ИК-спектры НПВО субстанции РУ 1205(13а – в области от 600 до 4000см-1, 13б – в области от 600 до 1800 см-1)61Поскольку субстанция гигроскопична, в ее ИК-спектрах наблюдаласьвыраженная полоса поглощения адсорбционной воды (при 3430 обратныхсантиметров), даже после высушивания субстанции до постоянной массы.Это, вероятно, объясняется быстрым поглощением атмосферной влаги впроцессе приготовления пробы.
На ИК-спектрах НПВО высушенной допостоянной массы субстанции РУ 1205 эта полоса поглощения былазначительно менее интенсивной и не перекрывала характеристическиеполосы поглощения РУ 1205. Кроме того, ее интенсивность была болеепостоянной.Поэтому в качестве метода подтверждения подлинности РУ 1205 всубстанциирекомендуеминформативный,сиспользоватьпредварительнымметодИК-НПВО,высушиваниемкакболеесубстанциидопостоянной массы.3.2.3. ПМР-спектроскопияВ ПМР-спектре РУ 1205, снятом в ДМСО-d6 (концентрация 2%), δ, м.д.наблюдаются следующие сигналы: 3,49 (4Н, м., СН2 – N – CH2 -); 3,72 (2Н,т., СН2); 3,90 (4Н, м., -СН2 – О – СН2-); 4,99 (2Н, т., СН2); 7,36 (2Н, м., ArF);7,42 (1Н, т., ArH); 7,52 (1Н, т., ArH); 7,95 (1H, д.д., ArH); 7,97 (2Н, м., ArF);8,01 (1Н, д.д., ArH); 8,53 (1Н, с., Ar3-H) (рис.
15).Рис. 15. ПМР-спектр РУ 1205 в ДМСО-d662ПМР-спектры всех образцов субстанции РУ 1205 были практическиидентичны.3.3. Определение родственных примесей в субстанции РУ 1205Для определения родственных примесей в субстанции РУ 1205 быларазработана методика с применением обращено-фазовой высокоэффективнойжидкостной хроматографии.В нашем распоряжении имелись образцы исходного вещества (примесь1) и промежуточных продуктов синтеза (примеси 2 и 3) субстанции РУ 1205,которые могут присутствовать в ее образцах как технологические примеси(табл.
6)Таблица 6Технологические примеси РУ 1205N2-аминобензимидазол (примесь 1)NH2NHNNH22-амино-1-морфолино-NH2C NH2COOH2C CFNNH2BrNH2CH2C NOэтилбензимидазол (примесь 2)бромид 2-амино-1-морфолиноэтил-3-(4-фторфенацил)бензимидазолия (примесь 3)При выборе состава подвижной фазы были использованы ацетонитрил,метанол, 0,015М растворы калия фосфорнокислого двузамещенного сразличными значениями рН (от 3,5 до 7,8). pH растворов доводили донужных значений с помощью концентрированной фосфорной кислоты.Поиск оптимальной степени разделения примесей и РУ 1205проводилсянатреххроматографическихколонкахнаоснове63октадецилсилана разных производителей: Luna C18, 150 × 4,6 мм, 5 мкм(Phenomenex, США) (колонка 1); GraceSmart RP 18, 150 × 4,6 мм, 3 мкм, (W.R.
Grace & Co.-Conn., США) (колонка 2) и BDS Hypersil C18, 150 × 4,6 мм, 5мкм (Thermo scientific, США) (колонка 3).С целью выбора оптимальных условий хроматографирования намибыли приготовлены растворы индивидуальных веществ: РУ 1205 и примесей1, 2 и 3, а также модельные смеси, содержащие все эти соединения в одномрастворе.Согласнорезультатам,полученнымприопределениирастворимости субстанции РУ 1205 и примесей, пробы растворяли в смесиметанол – вода (1:1).При хроматографировании модельной смеси РУ 1205 и примесей 1, 2 и3 на колонке 1 наблюдалось выраженное размывание «тыла» пиков РУ 1205и свидетелей примесей, что приводило к асимметрии пиков и мешало ихполному разделению.Изучение влияния рН подвижной фазы на хроматографическоеразделение РУ 1205 и свидетелей технологических примесей показало, чтовремя удерживания примеси 3 в значительной степени зависит от значениярН раствора калия гидрофосфата. Так, в условиях элюирования смесьюацетонитрил – 0,015М раствор калия гидрофосфата (1:1) при значении рН 4,4относительное время удерживания примеси 3 составило 0,68, а при значениирН 6,3 относительное время удерживания примеси 3 составило 1,1 (Рис.
16 а,б).По всей видимости, это связано с тем, что примесь 3 в слабокислойсреде находится в ионизированном состоянии и хуже удерживаетсясорбентом колонки.Также было отмечено, что размывание тыла пиков исследуемыхсоединений на колонке 1 наблюдалось вне зависимости от значения рНводного компонента подвижной фазы.64Рис. 16аРис. 16бРис. 16. Типичная хроматограмма разделения примесей и РУ 1205 приразличных значениях pH буферного раствора (а – 4,4; б – 6,3) на колонкеPhenomenex Luna 150 х 4,6 мм, где 1, 2, 3 – пики примесей 1, 2 и 3соответственно (концентрация каждой примеси – 0,05 мг/мл), 4 – пик РУ1205 (концентрация РУ 1205 – 1 мг/мл)При использовании колонки 2 также наблюдалась выраженнаяасимметрия пиков анализируемых соединений, особенно пиков свидетелейпримесей, что затрудняло ее дальнейшее использование.65Рис. 17. Типичная хроматограмма разделения примесей и РУ 1205 наколонке Grace GraceSmart RP 18 3 мкм, 150 × 4,6 мм, где 1, 2, 3 – пикипримесей 1, 2, 3 соответственно (концентрация каждой примеси – 0,05мг/мл), 4 – пик РУ 1205 (концентрация РУ 1205 – 1 мг/мл)Добиться полного разделения РУ 1205 и его технологических примесейбез значительной асимметрии пиков удалось в следующих условиях: вкачестве подвижной фазы использовалась смесь ацетонитрила, метанола и0,015М раствора калия фосфорнокислого двузамещенного трехводного,доведенного до pH 7,4 ортофосфорной кислотой концентрированной, всоотношении 100:100:150 по объему; стальная колонка Hypersil BDS С18размером 150 × 4,6 мм, 5 мкм (колонка 3); колонка не термостатировалась;скорость потока подвижной фазы в изократическом режиме элюирования–1,0 мл/мин (рис.
18).16. 3 mV4561273ch11234567891011121314минРис. 18. Хроматограмма модельного раствора РУ 1205 и вероятныхтехнологических примесей (4 – примесь 1, 5 – примесь 2, 6 – примесь 3, 7 –РУ 1205, концентрация всех соединений 0,05 мг/мл)66С целью выбора аналитической длины волны были получены УФспектры РУ 1205 и технологических примесей в подвижной фазеацетонитрил –метанол – 0,015М растворкалия фосфорнокислогодвузамещенного трехводного (pH 7,4) (100:100:150 об/об/об) (рис. 19).НаоснованиианализаУФ-спектроврастворовРУ1205итехнологических примесей была определена аналитическая длина волны –275 нм.
При данной длине волны наблюдалось совпадение полос поглощениярастворов всех исследуемых соединений.УФ-спектр раствора РУ 1205(0,02 мг/мл)УФ-спектр раствора примеси 1(0,02 мг/мл)УФ-спектр раствора примеси 2(0,1 мг/мл)УФ-спектр раствора примеси 3(0,02 мг/мл)Рис. 19. УФ-спектры растворов РУ 1205 и его промежуточныхпродуктов синтеза в подвижной фазеВ указанных выше условиях на колонке 3 происходило полноеразделение технологических примесей и РУ 1205. Параметры разделения, атакже пределы обнаружения и количественного определения исследуемыхсоединений представлены в таблице 7.67Таблица 7Параметры разделения и пределы обнаружения и количественногоопределения РУ 1205 и свидетелей технологических примесей№п/п1234СоединениеОтносительноевремяудерживания,tотнРУ 12051,00Примесь 10,16 ± 0,01Примесь 20,18 ± 0,01Примесь 30,25 ± 0,02Числотеоретических тарелок,N7424 ± 12387186 ± 13452445 ± 1504042 ± 383ФакторРазрешениеасимметсоседнихрии пика,пиков, RsQ1,3 ± 0,011,1 ± 0,01 1,6 ± 0,1 (1-2)1,1 ± 0,01 2,0 ± 0,1(2-3)1,2 ± 0,01 12,46 ± 0,3(3-4)ПО,мкгПКО,мкг0,00080,00160,00200,00120,00260,00530,00660,0040Для изучения зависимости площадей пиков от концентрации растворовРУ 1205 и его технологических примесей и выбора рабочей концентрациираствора субстанции РУ 1205 для анализа родственных примесей былиприготовлены растворы в подвижной фазе с концентрацией от 0,0001 мг/млдо 0,05 мг/мл.Линейная зависимость площади пика от концентрации РУ 1205 при 275нм была подтверждена в пределах интервала от 0,001 до 0,05 мг/мл, примеси3 – от 0,0002 до 0,01, примеси 2 – от 0,0004 до 0,05 мг/мл, примеси 1 – от0,0003 до 0,04 мг/мл, коэффициенты корреляции не менее 0,999 (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
