Диссертация (1141264), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Для этого0,020 г субстанции РУ 1205 (точная навеска) помещали в мерную колбувместимостью 20 мл прибавляли около 18 мл смеси метанол – вода (1:1),тщательно перемешивали,доводили до меткитем же растворителем.(раствор А, концентрация РУ 1205 – 1 мг/мл). 1 мл раствора А переносят вмерную колбу вместимостью 100 мл, доводят до метки тем жерастворителем, тщательно перемешивают (раствор РСО, концентрация РУ1205 – 0,01 мг/мл).В расчетах использовались поправочные коэффициенты, которыесоставляли: 1,031 для примеси 1; 2,248 для примеси 2 и 2,426 для примеси 3.Формула расчета содержания единичной примеси (Х, %) следующая:навнавгде Sпр – площадь пика индивидуальной примеси;Sст – площадь пика РУ 1205 на хроматограмме раствора РСО;mст –масса навески РСО РУ 1205, г;mнав – масса навески растертых таблеток РУ 1205, г;109mср – средняя масса таблетки РУ 1205, г;С – содержание РУ 1205 в одной таблетке, г;W – количественное содержание РУ 1205 в РСО, %;Zст – потеря в массе РСО РУ 1205, %.Типичная хроматограмма извлечения из таблеток РУ 1205, покрытыхпленочной оболочкой, представлена на рис.
33.8.95 mV1 2345 6711129813ch112345678910111213141516171814минРис. 33. Типичная хроматограмма извлечения из таблеток РУ 1205,покрытых пленочной оболочкой, серия 20213, где 1,2 и 3 – пики плацебо; 10– пик РУ 1205 в концентрации 1 мг/мл, 6 – пик примеси 2, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 12,13, 14 – неидентифицированные примесиВ таблице 24 представлены результаты анализа родственных примесейв образцах таблеток РУ 1205, покрытых пленочной оболочкой. В образцахтаблеток была обнаружена примесь с относительным временем удерживания,совпадающим с относительным временем удерживания примеси 2 (0,73±0,3),содержаниекоторойнепревышало0,3%,атакжедругиенеидентифицированные примеси. Содержание единичной примеси во всехобразцах не превышало 0,35%, а сумма примесей – 0,9% [Илларионов А.
А. идр., 2015].110Таблица 24Результаты определения родственных примесей в таблетках РУ 1205Относительноевремя удерживания0,378 ± 0,010,411 ± 0,020,688 ± 0,010,730 ± 0,030,831 ± 0,010,871 ± 0,020,971 ± 0,021,050 ± 0,011,070 ± 0,021,145 ± 0,031,200 ± 0,03Сумма примесей, %Содержание родственных примесей, %202133021340213502130,03370,02370,00760,01070,01360,29510,26910,26890,20840,02130,01840,01510,05800,05520,01990,03030,06410,05370,03830,03330,31440,32080,29600,27970,03510,02150,02450,01660,03510,03070,02450,02270,02590,01840,01840,01360,85660,79850,72420,6570602130,03930,17670,01660,26310,03770,29330,04380,02260,8931Таким образом, проведенные валидационные исследования двухметодик определения содержания родственных примесей (в изократическоми в градиентном режимах) свидетельствуют о том, что методики обладаютспецифичностью, обусловленной выбором аналитической длины волны УФдетектора и полным разделением примесей и РУ 1205.
Показано, что визократическом режиме элюирования полного разделения технологическойпримеси 1 и плацебо не происходит, однако влияние пиков плацебо наплощади пиков технологической примеси 1 незначительно. Тогда как прииспользовании методики градиентного анализа влияния плацебо удаетсяизбежать полностью, что свидетельствует о более высокой специфичностиэтой методики.Пределы обнаружения и количественного определения примесей визократическом режиме выше, чем в градиентном (см. табл. 4 и 17).Обе методики определения обладают приемлемой сходимостьюблагодаря низким значениям диапазона доверительного интервала икоэффициента вариации (ΔX не более 3% и RSD не более 3,5%).111Значения вычисленного коэффициента Стьюдента (табл.
14 и 18), атакже то, что доверительные интервалы включают значение 100%,свидетельствует об удовлетворительной правильности методик, однако приопределении примеси 3 в изократическом режиме и градиентном результатыбыли отягощены систематической ошибкой. По всей видимости, присутствиесистематической ошибки обусловлено недостаточным извлечением примеси3 из модельных смесей с плацебо.
Величина ошибки невелика и непревышает 3,5% для обоих случаев.При использовании двух альтернативных методик удалось подтвердитьналичие в образцах таблеток технологической примеси 2 в содержании неболее 0,3% согласно методике в градиентном режиме.Согласно данным анализа в изократическом режиме содержаниеединичной примеси в образцах таблеток не превышало 0,24%, а суммапримесей не превышала 0,81%. При использовании градиентного режимабыло установлено, что содержание единичной примеси во всех образцах непревышало 0,35%, а сумма примесей – 0,9%.В результате проведенных исследований для определения родственныхпримесей в таблетках РУ 1205, покрытых пленочной оболочкой, былавыбрана методика ВЭЖХ в градиентном режиме элюирования из-за ее болеевысокой специфичности.4.6. Количественное определениеКоличественное определениеРУ 1205в таблетках, покрытыхоболочкой, проводили методом ВЭЖХ в условиях определения родственныхпримесей в изократическом режиме элюирования, поскольку эта методикаобладает большей чувствительностью и требует меньших затрат времени иреактивов.Специфичность методики подтверждается полным разделением пиковплацебо и известных технологических примесей и пика РУ 1205 (см.
рис. 23).112В качестве рабочей концентрации испытуемого раствора для получениянаиболее стабильных результатов было решено взять 0,02 мг/мл, посколькуэта концентрация находилась в пределах интервала линейности и даваламеньшие значения относительного стандартного отклонения площадейпиков, чем концентрация 0,01 мг/мл.Линейная зависимость площади пика растворов РУ 1205 от ихконцентрации была подтверждена на модельных смесях РУ 1205 и плацебо вдиапазоне концентраций от 0,016 мг/мл до 0,024 мг/мл (0,02 мг/мл ± 20%)(рис.
34).180160y = 6006,2x + 8,8977R2 = 0,9991Площадь пика, ед14012010080604020000,0050,010,0150,020,0250,03Концентрация, мг/млРис. 34. Зависимость площади пика от концентрации модельных смесейРУ 1205 и плацебоПравильность и прецизионность (сходимость) методики также былаизучена на модельных смесях плацебо и субстанции РУ 1205.Для приготовления модельных смесей от 0,016 до 0,024 г (точнаянавеска) субстанции РУ 1205 переносили в мерную колбу вместимостью 50мл, затем в ту же колбу прибавляли 0,400 г (точная навеска) плацебо и около40 мл смеси метанол - вода (1:1) и помещали на ультразвуковую баню на 15мин. Затем содержимое колбы доводили до метки тем же растворителем и113фильтруютчерезмембранныйфильтрNylon(PA)(Fisherbrand,Великобритания) с диаметром пор 0,45 мкм.1 мл полученного раствора переносили в мерную колбу вместимостью20 мл и доводят объем раствора до метки подвижной фазой, перемешивают(испытуемый раствор, концентрация РУ 1205 – от 0,016 до 0,024 мг/мл).При хроматографировании испытуемых растворов в указанных вышеусловияхнаблюдаетсяполноеразделениепиковизвлеченияизвспомогательных веществ, пиков технологических примесей и пика РУ 1205(рис.
23), вспомогательные вещества проведению анализа не мешают.В таблице 25 представлены результаты количественного определенияРУ 1205 в модельных смесях с концентрацией РУ 1205 от 0,016 мг/мл до0,024 мг/мл.Таблица 25Результаты количественного определения РУ 1205 в модельных смесяхметодом ВЭЖХВзято Найдено Найдено РУ Абсолютная ОтносительнМетрологическиеРУ 1205, РУ 1205,1205, %ошибка, ая ошибка, %характеристикимг/млмг/мл (X=m2х100/мг/мл(Y=dх100/m1(P=95%, n=9)(m1)(m2) m1)(d=m2 - m1))0,0162 0,0164101,23+0,00021,23Хср= 99,86%0,0171 0,017099,41-0,00010,39S = 1,200,0181 0,0182100,55+0,00010,55Sxcp= 0,40,0192 0,0195101,56+0,00031,56ΔX = 0,940,0203 0,020199,01-0,00020,99ε = 0,94%0,0211 0,0213100,94+0,00020,94tвыч=0,350,0220 0,021798,64-0,00031,36tтабл=2,360,0232 0,023099,13-0,00020,87RSD = 1,20%0,0243 0,023998,35-0,00041,65Как видно из таблицы, относительная ошибка количественногоопределения РУ 1205 на модельных смесях не превышает 1%.Значение вычисленного коэффициента Стьюдента (tвыч) не превышаеттабличное (tтабл), результаты не отягощены систематической ошибкой, чтосвидетельствует о правильности методики.
Значение коэффициента вариации114не превышает 2%, что свидетельствует о приемлемой сходимости методики[Береговых В. В. и др., 2008].Сприменениемразработаннойметодикибылопроведеноколичественное определение серийных образцов таблеток РУ 1205.Для приготовления испытуемого раствора около 0,105 г (точнаянавеска) массы растертых таблеток РУ 1205 переносили в мерную колбувместимостью 25 мл, прибавляли около 20 мл смеси метанол - вода (1:1) ипомещали в ультразвуковую ванну на 15 мин.
Затем содержимое колбыдоводили до метки тем же растворителем и фильтровали через мембранныйфильтр Nylon (PA) (Fisherbrand, Великобритания) с диаметром пор 0,45 мкм.1 мл полученного раствора переносили в мерную колбу вместимостью10 мл и доводят объем раствора до метки подвижной фазой, перемешивают(испытуемый раствор, концентрация РУ 1205 – 0,02 мг/мл).Для приготовления раствора РСО около 0,020 г (точная навеска)субстанции РУ 1205 помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл,растворяли в достаточном объеме смеси метанол - вода (1:1) и доводят объемраствора до метки тем же растворителем.1 мл полученного раствора переносили в мерную колбу вместимостью10 мл, доводили объем раствора до метки подвижной фазой, перемешивали(стандартный раствор, концентрация РУ 1205 – 0,02 мг/мл).Приготовлениерастворадляпроверкипригодностихроматографической системы и проверку пригодности хроматографическойсистемы проводили так же, как и при определении показателя «Родственныепримеси» для методики с изократическим режимом элюирования.Перед проведением анализа колонку уравновешивали подвижнойфазой до достижения стабильной базовой линии, проводили холостой опыт.Формула для расчета содержания РУ 1205 в одной таблетке (Х, г)следующая:115где А1 – оптическая плотность испытуемого раствора;А0 – оптическая плотность стандартного раствора;а1 – масса навески растертых таблеток РУ 1205;а0 – масса навески РСО РУ 1205;mср – средняя масса таблетки;W – количественное содержание РУ 1205 в РСО, %;Zст – потеря в массе РСО РУ 1205, %.Содержание РУ 1205 в одной таблетке должно составлять от 0,00925 гдо 0,01075 г (0,01 г ± 7,5%).Результаты количественного определения РУ 1205 в таблеткахпокрытых пленочной оболочкой, усредненные по 5 хроматограммам,представлены в таблице 26.Таблица 26Результаты количественного определения таблеток РУ 1205Номер серии020213030213040213Содержание РУ0,0092770 0,0092944 0,00932971205, г/табл0502130602130,00935600,0093721Таким образом, разработанная методика количественного определенияРУ 1205 в таблетках методом изократической ВЭЖХ специфична, линейна впределах диапазона применения, правильна (доверительный интервалвключает 100% и результаты не отягощены систематической ошибкой) ипрецизионна (RSD не более 2%), что позволяет включить ее в проект НД напрепарат [Илларионов А.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
