Диссертация (1141107), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Н. Миронова (2012) с коррекцией на имеющиеся разрешения дляиспользование этих препаратов в клинической практике. Были отобраныпо 5 золотистых хомяков для каждого изучаемого препарата. Суточнаятерапевтическая концентрация препаратов определялась максимальнойконцентрацией, рекомендованной инструкцией фирмы производителя длячеловека со среднестатистическим весом 60 кг для внутримышечноговведения и соответствовала таковой, используемой в медицинскойпрактике. Для золотистого хомяка эта доза определялась на 100 г массытела.Осуществлялипоследовательноеувеличениеконцентрацииизучаемых антибактериальных препаратов в 5 и 10 раз, меглуминаантимоната – в 3 и 5 раз, интерферона альфа-2b человеческогорекомбинантного (реаферона) – в 10 и 20 раз. Максимальный периоднаблюдения за животными при изучении токсичности препаратов составил3 недели. Токсичность препарата оценивалась по изменению массы телаживотных на 16 и 21 дни эксперимента по сравнению с исходной.Учитывалисьихповеденческиереакциииизменениеаппетита.Критическим исходом являлся смертность животного.5.Изучение эффективности препаратов in vivo на лабораторноймодели ЗКЛ включало несколько этапов.5.1.ПодготовкаЭкспериментальноинфекционногоКЛнаматериалалабораторноймоделидлязаражения.воспроизводилипромастиготами лейшманий, т.к.
это более близко к естественномуинфицированию. Промастиготы культивировали питательных средах (см.выше) и дозировали под контролем камеры Горяева.Заражениеосуществлялось культуральными формами высоковирулентных штаммовL. major, выделенных из язв человека или грызунов эндемичныхтерриторий и хранившихся в криобанке Института. Учитывался фактвозможности утраты вирулентности промастигот в процессе длительного40культивирования на искусственных питательных средах. Для сохраненияоптимальной вирулентности биомассы L.
major проводился однодвукратный пассаж возбудителей на питательных средах. Культурулейшманий выращивали при температуре 20–25°С на среде NNN. Длязараженияиспользовали10-14дневнуюкультуру.Взвесьдляинфицирования животных являлась годной при концентрации паразитов106 в 0,05 мл.5.2.Выбор адекватной модели животного. В качестве экспериментальноймоделидляисследованияпротиволейшманиальнойактивностилекарственных препаратов in vivo использовали золотистых хомяков, какнаиболее восприимчивых животных к данной инфекции в природныхусловиях [30]. Выбор данных животных был актуален и в связи с тем, чтомы использовали лабораторную культуру L.
major, хранившуюся долгоевремя в криобанке института. Это требовало выбора более чувствительнойэкспериментальной модели для заражения. Методика была согласована сведущими лейшманиологами РФ, работающими в Институте медицинскойпаразитологии, тропических и трансмиссивных заболеваний им. Е. И.Марциновского Первого МГМУ им. И. М. Сеченова Е. Н. Понировским иМ. В. Стрелковой. Работа соответствует конституции РФ, правилам инормам (законам, стандартам, распоряжениям, актам и т.п.) национальногоимеждународногозаконодательства,касающегосяиспользованияживотных в научных исследованиях. Эксперименты проводились насамцах золотистых хомяков 2-х месячного возраста. Их масса составлялаоколо 30 г.5.3.Методика введения инфекционного агента.
Каждому животномупутем внутрикожной инъекции вводили около 2 млн. паразитов в видесуспензии культуры L. major. Инъекции делали в две области: пах(минимальный волосяной покров) и уши (наиболее частый очаг зараженияживотных в природных условиях). Это увеличивало вероятность развитияинфекционного процесса в коже и давало возможность получить41многоочаговый процесс.
При введении препаратов в кожу обязательнымусловием являлось появление в месте инъекции «лимонной корочки».5.4.Критерии отбора хомяков для эксперимента in vivo. Основнымкритериемявляласьстепеньместногопоражениякожи,котораяопределялась по специальной шкале: «0» – отсутствие поражения; «+» –инфильтрация; «++» – изъязвление; «+++» – образование язвы с коркой;«++++» – обширная язва; «++» – затихание процесса, начало эпителизации;«+» – дальнейшее заживление, сопровождающееся шелушением; «0» –полная эпителизация.5.5.Визуальная оценка эффективности препаратов по динамике кожногопроцесса.
Для этого использовали животных при степени местногопоражения «+++» и «++++». Рассчитывался средний показатель поражениякожи в каждой группе до начала лечения и после завершения курсатерапии. Он равнялся сумме всех крестов в группе, деленной на числоживотных в ней. Учитывался размер язв, который определялся измерениемее длины и ширины с последующим вычислением площади очага1122поражения в см2 по формуле: S = D ×d × π, где D – длина большойоси эллипса, d – длина малой оси эллипса, π = 3,14.
Сумма площадейотдельных язв, деленная на число животных в группе, составляет среднийразмер лейшманиомы для этой группы животных. Дополнительнымкритерием являлась глубина поражения, которая регистрировалась вспециальном журнале учета. Степень местного поражения и площадьпораженного участка определяют каждую неделю.5.6.Микроскопическая оценка эффективности лечения по элиминациивозбудителя из очагов поражения на коже. Для этого проводили подсчетколичества лейшманий в мазках. Для этого использовалась схема: «0» –отсутствие лейшманий; «+» – 1 лейшмания на 1–9 полей зрения; «++» – от2 до 10 лейшманий в 1-м поле зрения; «+++» – от 11 до 50 лейшманий в 1м поле зрения; «++++» – более 50 лейшманий в 1-м поле зрения. Наличие42лейшманий в отделяемом язвы и ее периферических тканях, где имелосьвоспаление, проводили 2 раза в месяц.
Отрицательным результатомсчиталась гибель животного в ходе эксперимента.5.7.Проводилась фоторегистрация динамики клинических проявленийна коже животных. Обязательным являлось фоторегистрация кожногодефекта до начала лечения, на 30-й и на 60-й дни от начала лечения.6.Статистическая обработка материала. Обработка результатовисследованияпроведенасиспользованиемпакетастатистическихпрограмм “STATISTICA 6.0». Данные шифровали в программе EXCEL.Описательнаястатистикаколичественныхпризнаковпредставленасредними и среднеквадратичными отклонениями (в формате M±m). Дляанализанормальнораспределенныхпризнаковпараметрические методы (t-критерий Стьюдента).применялись43ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ3.1.Исследование эффективности препаратов для терапии зоонозногокожного лейшманиоза in vitroДля проведения лабораторных исследований использовалась культура L.major, полученная от больных путем аспирации из очага инфекции ихранившаяся в криобанках института.
Для оценки специфической активностипрепаратов использовали методику, описанную в «Руководстве по проведениюдоклинических исследований лекарственных средств» под редакцией проф. А.Н. Миронова (2012). Наращивание биомассы проводилось в течение 8 дней напитательной двухфазной среде. В качестве твердой фазы был взят кровянойагар NNN (Novy-Neal-Nicolle). Жидкой фазой служила смесь среды 199 и 0,5%раствора гидролизата лактальбумина. Для подсчета числа промастиготиспользовали камеру Горяева.Изучали активность трех антибактериальных препаратов: Цефотаксим (Клафорана, Франция) Цефтриаксон (Россия) Доксициклин (Россия).Возбудители разных нозологических форм лейшманиозов имеют большоеморфологическое сходство.
В жизненном цикле лейшманий имеются двестадии развития. Одна из них развивается в организме млекопитающих каквнутриклеточный паразит моноцитарных клеток кожи (кожные формыинфекции) и внутренних органов (печень, селезенка, костный мозг и др.) привисцеральном лейшманиозе. Это лейшманиальная форма – амастигота. Онанеподвижна и не имеет жгута. Промастигота (лептомонада или жгутиковаяформа) развивается в организме москита, переносчика данной группыинфекции, а также в культурах на искусственных питательных средах при44температуревинтервале20-28оСивпереживающихкультурахперитонеальных макрофагов при 37 о С.Культуры лейшманий на кровяных средах поддерживали без примененияантибиотиков. Для посева использовали культуры из пробирок, при этом вконтрольные пробирки вносили чистую среду, а в опытные пробирки вносилисреду,вкоторуюпредварительнодобавилисуспензиюпромастиготлейшманий.
Эту смесь разливали по мини-пробиркам в объеме 0,47 мл, затем вкаждую опытную пробирку вносили двукратные разведения испытуемыхвеществ, в объеме 0,03 мл. Через 5 дней инкубации при 22–25°С в темнотесодержимое пробирок исследовали в свежем и окрашенном мазке. Такимобразом,полностьюопределялиподавляетминимальнуюростконцентрациюпромастигот,т.е.препарата,котораялейшманиястатическуюконцентрацию испытуемого вещества.Последовательное увеличении концентрации препаратов, в соответствии сметодикой, проводилось пошагово – в 2, 4, 6, 8, 10 раз. Разведение порошковлекарственных препаратов осуществлялось в соответствии с инструкциейфирмы производителя к каждому из них. Анализ результатов дан сиспользованием двух статистически достоверных вариантов концентраций,обозначенных как min и max.Важно отметить, что у меглумина антимоната (меглумина антимоната)увеличение концентрации проводилось также пошагово, однако в связи с тем,что меглумина антимонат выпускается в виде раствора, то увеличениеконцентрации в 6, 8 и 10 раз привело бы к излишнему объему в испытуемыхпробирках, что обусловливало автоматически увеличение объема препарата.Поэтому увеличение концентрации меглумина антимоната (МА) проводилосьтолько в 2 и 4 раза (рисунок 1).МА, гпоследовательное увеличение дозы в 2 и 4 раза0,0090,0180,036Рисунок 1 – Дозы меглумина антимоната, последовательно увеличиваемыедля изучения противолейшманиальной эффективности in vitro45Контрольные группы:1 группа – пробирки с жидкой средой 199 с солями Хенкса (требованияпротокола).2 группа – учитывая, что препарат пятивалентной сурьмы – глюкантим(Франция), длительное время являлся «золотым стандартом» при лечениилюбых форм лейшманиоза, его использовали в качестве стандарта.Для испытуемых антибактериальных препаратов (МНН – доксициклин,цефотаксим,цефтриаксон)разницаминимальнойимаксимальнойконцентрациями составила в 10 раз.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
