Диссертация (1140769), страница 9
Текст из файла (страница 9)
23).Рисунок 23. 30-е сутки после имплантации матрицы. Окраска по Маллори. х 200. Определяется большоеколичество коллагеновых волокон, окрашенных в синий цвет.57На60суткиэпителий,выстилающийвнутреннююповерхностьновообразованной на месте ТИК уретры, более дифференцирован, чем на 30-есутки: он имеет типичную для уротелия многорядную структуру, но базальнаямембранаместамиещенедостаточнодифференцирована.Подлежащаясоединительная ткань близка по структуре к интактной собственной пластинкислизистой оболочке уретры (рис.
24).Рисунок 24. 60-е сутки после имплантации. Окраска гематоксилин-эозином. х400. Эпителий более зрелыйимеет типичную для уротелия многорядную структуру.58На90суткиуротелийимеет нативнуюструктуру сполностьювосстановленной базальной мембраной, четко видны сосочки регенерировавшейслизистой оболочки (рис. 25).
Новообразованная слизистая оболочка практическине отличается от слизистой оболочки интактной уретры, причем она прочносоединена с мышечной оболочкой и кавернозным телом.Рисунок 25. 90-е сутки после имплантации. Окраска гематоксилин-эозином. х400. Определяется базальнаямембрана, эпителий зрелый, многорядный, видны сосочки слизистой уретры.Таким образом,матрица на основе сетки из полилактогликолида иреконструированного начинает замещаться уроэпителием с 30 дня. Данныйпроцесс полностью завершается к 90-м суткам. Интересно отметить, что уже на30-е сутки волокна полилактогликолида перестают определяется в местеимплантации, которое покрывается соединительной тканью, близкой к структуресобственной пластинки слизистой оболочки в интактной уретре.593.10 Результаты оценки цитотоксичности и клеточной адгезии матрицы наоснове сетки из полилактогликолида и реконструированного коллагенаМТТ-тестирование показало отсутствие токсичности исследуемых образцовматрицы при использовании культур линейных фибробластов 3Т3 и С3Н.Результаты спектрофотометрии приведены на рисунке 26.Рисунок 26.
Результаты значений оптической плотности для тестируемой матрицы с культурами клеток3T3 и C3H.Значения оптической плотности при МТТ0,450,40,350,30,250,20,150,10,0503T3C3HКонтроль средыВывод:1)матрица не токсична2)пролиферация отмечена на всех образцах матрицы3)протокол отмывки от следов формальдегида подходит дляданного исследованияАдгезия и пролиферация клеток отмечена на всех исследуемых образцахматрицы,приэтомзначительнопреобладаютклеткисвысокойжизнеспособностью.60Рисунок 27.
Матрица + C3H, 8 сут. Конфокальная микроскопия и проходящий свет.Матрица + С3Н, 8 сут. культивирования. Конфокальная микроскопия ипроходящий свет. Тени нитей сетки из полилактогликолида. Живые клетки –зеленого цвета, мертвые – красного цвета. Окраска: акридиновый оранжевый иэтидиум бромид (рис. 27).Рисунок 28. Матрица + 3Т3, 6 сут. культивирования. Конфокальная микроскопия.61Матрица + 3Т3, 6 сут. культивирования. Конфокальная микроскопия. Живыеклетки – зеленого цвета, мертвые – красного цвета.
Окраска: акридиновыйоранжевый и этидиум бромид (рис. 28).Таким образом, клетки линий 3Т3 и C3H адгезируются и пролиферируют наисследуемой гибридной матрице, что позволяет рассматривать такой материал вкачестве эффективных носителей клеток и предполагает их возможноеиспользование в качестве каркаса для тканеинженерной конструкции.Глава 4. ОбсуждениеРеконструктивно-пластическая хирургия, в частности, заместительнаяуретропластика своей целью ставит использование лоскутов или трансплантатов,для замещения дефекта ткани, в отношении уретропластики, увеличение зонысужения.Неоднократнопредпринималисьипредпринимаютсяпопыткивнедрения альтернативных материалов для замещения суженной части просветамочеиспускательного канала [16, 21].
Учитывая бурное развитие тканевойинженерии, которая в настоящее время предлагает многочисленные, какприродные, так и синтетические материалы в качестве матрицы для созданиятканинженерных конструкций, в настоящее время предприняты многочисленныепопытки внедрения различных матриц в качестве аналогов аутотрансплантатов, вчастности, транспланатов без осевого кровоснабжения - графтов.Еще в далеком 1998 году 1998 г. Kropp et al. [73] предложили использоватьSIS в качестве матрицы для заместительной уретропластики. В последующемиспользовались другие децеллюризированные матрицы для достижения даннойцели: 1999 году, Chen et al.
[60] использовали BAMG (obtained and processed fromporcine bladder submucosa) для вентральной onlay уретропластики. В 2003Nuininga et al, [77] проводил эксперимент по оценке тканеинженернойуретропластики, используя используемой матрицы: SIS. В 2004 году Yang et al.[80] использовали в качестве «заплатки» (patch) ACSM (acellular corpusspongiosum matrix), полученный путем децеллюляризации ткани уретры усакрифицированных животных.
Производили заместительную пластику уретры,62протяженностью 10-15 мм. Через 3 недели происходила полная эпителизацияматрицы; через 6 месяцев отмечено появление пучков гладкомышечных клеток.Используемые матрицы представляют собой децеллюляризированныегетеро- или гомогенные графты. По сути, эти матрицы являются коллагеновымиграфтами, лишенные каких-либо нативных клеточных элементов, что обусловилоих низкую иммуногенность и биоактивность.
Успех использования бесклеточныхматриц зависит от степени васкуляризации графта и степени регенерациинативной слизистой оболочки, в зоне имплантации матрицы. В большинствеисследований, эпителизация матриц происходила в течение 4-х недель. Общимдля данных исследований так же было отсутствие осложнений или ихминимальноеколичество,стоитпринятьвовнимание,достаточно«доброкачественный» характер данных осложнений – отсутствие стриктур, лишьформирование дивертикулов уретры.Таким образом, наиболее перспективной в отношении носителя клеток длятканеинженерной конструкции оказалась децеллюризированная коллагеноваяматрица.Именно исходя из этой позиции, а так же принимая по внимание успехприменения бесклеточного графта в сосудистой хирургии [4] первоначально дляформирования тканеинженернойконструкциивыбрана децеллюризованнаяартериальная стенка человека.С учетом результатов экспериментов по имплантации коллагеновая матрицана основе децеллюляризированной трупной артерии человека обладает низкойбиологической активностью и безопасна в качестве материала для заместительнойуретропластики; данных проведения оценки цитотоксичности и проверкиклеточной адгезии ( матрица на основе децеллюляризированной трупной артериичеловека не проявляет цитотоксичных свойств, линии клеток (3T3 и C3H)адгезируют к поверхности матрицы на основе децеллюляризированной трупнойартерии человека); а также принимая во внимание данные экспериментальнойуретропластики у самцов кроликов(ДМТАС)вкачествематериала- использование сосудистой матрицыдлязаместительнойуретропластикив63эксперименте на кроликах показало хороший структурный и функциональныйрезультат, выявлена медленная деструкция матрицы и прогрессирующаяэпителизация соединительнотканной капсулы - данная матрица рассматривалась,как наиболее перспективная и подходящая для заместительной уретропластики учеловека.Послепроведенияэтическойэкспертизыиполученияразрешениялокального этического комитета Первого МГМУ им.
И.М. Сеченова проведеназаместительная уретропластика с использованием данной матрицы у человека.Ниже будет описано клиническое наблюдение уретропластики человека сприменением тканеинженерной конструкции на основе децеллюляризированнойматрицы из трупной артериальной стенки и клеток слизистой оболочки щеки.Больной Б., 1951 года рождения, с 2003 г. стал отмечать ухудшениемочеиспускания. В 2005г.
диагностирована доброкачественнаяпредстательнойжелезы,выполненапозадилоннаягиперплазияаденомэктомия.Послеудаления уретрального катетера мочеиспускание восстановилось. Спустя 1 мес.стал отмечать прогрессивное ухудшение мочеиспускания. При обследованиидиагностирована стриктура уретры. С 2005 по 2013 г. выполнялись многократныебужирования уретры, оптические уретротомии с временным положительнымэффектом. По данным рентгенологических методов обследования (ретрограднаяуретрография,микционнаяцистоуретрография)протяженностьстриктурыпроксимальной части луковичного отдела уретры составила 2,5 см (рис.
29).64Рисунок 29. Данные ретроградной (а) и микционной цистоуретрографии (б). Зоныстриктуры указаны стрелкой.Вкачествематрицыиспользоваласьдецеллюризированнаятрупнаяартериальная стенка, полученная ранее описанным методом [3]. После изъятиятрупнойартериимеханическифасциальный футляр, выделялиудалялипериартериальнуюклетчаткуиотходящие сосудистые ветви.
Затем артериюпромывали различными растворами и производили ферментную обработкураствором террилитина при 40˚С в течение 4 ч в фосфатном буфере с рН 7,5–8,0 ирасходе фермента 15–25 ПЕ/г влажной ткани. Контроль децеллюляризацииосуществляли морфологически (по отсутствию клеток на гистологических срезахартерии).
Промытые сосуды подвергали отжиму салфетками для удаленияизбыточной влаги и радиационной стерилизации (дозой 2,5 Мрад).Далее фрагмент слизистой оболочки щеки размерами 5×5 мм иссекали подместной анестезией 2 % раствором лидокаина. Рана донорской зоны зажилапервичным натяжением (без наложения швов). Клетки выделяли из данногофрагментасиспользованием 0,2% раствора диспазы(«Sigma»,США).Полученные клетки культивировали в полной культуральной среде, состоящей избессывороточнойсредыKeratinocyte-SFM(«LifeTechnologies»,США)сдобавлением инсулина в концентрации 5 мкг/мл, гидрокортизона 5 мкг/мл,эпидермального фактора роста 10 нг/мл, холерного токсина 10 10 М,трансферрина 5 мг/мл, аденина 1,8∙104 М, лиотиронина 2∙10-11М; в увлажненнойсреде при температуре 37°С в СО2-инкубаторе при концентрации СО2 5 %. Сменупитательнойсредыосуществляликаждые48ч.Продолжительностькультивирования клеток перед высеванием на матрицу составила 5 недель.
Привысевании на подготовленную матрицу размером 17×43 мм был использовантретий пассаж эпителиоцитов из расчета 3∙106клеток на 1 см2, после чегокультивирование продолжалось в течение 5 сут. до имплантации конструкции.Тканеинженерная конструкция была доставлена в урологическую клинику вспециальном термоконтейнере. Полученную тканеинженерную конструкцию65имплантировали пациенту в проксимальную часть луковичного отдела уретры потехнике Asopa (dorsalinlay).Техника операции.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
