Диссертация (1140769), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Технические особенности операцииописаны ниже. Проводили полную мобилизацию луковичной и проксимальнойчасти пенильной уретры кролика на протяжении 2,2–2,5 см (рис. 6, а). Полностью36иссекали фрагмент уретры по её дорсальной поверхности, размерами 2.0х0.5 см(рис. 6, б). Матрица фиксировалась к вентральной поверхности белочнойоболочки пещеристых тел одиночными узловыми швами викрил 5-0 по краям и вцентре (рис.
6, в). Сформированный дефект уретры замещали образцомгибридной матрицы, размеры которой, после адаптации под уретральное ложесоставляли 2,0 х 0,5 см. Края матрицы сшивали с краями уретры в зоне дефектанепрерывным швом, используя викрил 5-0. (рис. 6, г).Рисунок 6. Фотографии дорсальной уретропластики с применением гибридной матрицы на основевикриловой сетки и реконструированного коллагена.372.5 Описание методики проведения ретроградной уретроцистографии укроликовРетроградную уретроцистографию выполняли через 7, 30, 60 и 90 суткипосле выведения из эксперимента. Для этого на головку полового члена кроликапредварительно накладывали провизорную лигатуру (Vicryl 4-0); в наружноеотверстие уретры вводили торцевой мочеточниковый катетер с оливовиднымрасширением №8 Сh, по которому ретроградно вводили до 20 мл 38 % раствораурографина.2.7 Описание методики оценки клеточной адгезииОценку цитотоксичности проводили по оптимизированному методуМосмана и Монкса (МТТ-тест) на 6-е сутки культивирования с применениемлиний клеток 3T3 и C3H и с использованием методов световой микроскопии испекторофотометрии.После разморозки культур линейных клеток, культивирование проводили вполной питательной (ростовой) среде DMEM/F12 (Invitrogen, США), содержащей10% телячью фетальную сыворотку («HyClone Defined», HyClone, США),инсулин 0,4 мкМ, 0,25 мг/л гентамицина в количестве 2,0-2,5 млн.
кл/мл вкультуральныхфлаконах175см2(Corning,США).Культивированиеосуществляли в стандартных условиях в СО2-инкубаторе с концентрацией СО25%, атмосферного воздуха 95% и с повышенной влажностью. Заменукультуральной среды на свежую, осуществляли каждые 72 часа. Образцы матрицнарезали на фрагменты площадью 2 см2 и помещали в 12-ти луночный планшет.Плотность посева составляла для 3Т3 – 3×104 на 1 см2 и для С3Н – 7×104 клеток1 см2 (25% от монослоя). Время культивирования клеток на матрицах составляло6 суток, после чего проводили реакцию с 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромидом (МТТ) и инкубировали 4 часа.
Образованные кристаллыформазана растворяли в диметилсульфоксиде и определяли оптическую38плотность одинаковых объемов растворов в 96-луночном планшете с помощьюспектрофотометра (Мultiscan FC,Thermo Scientific) при длине волны 540 нм.Световую микроскопию проводили на микроскопе Nikon TE-2000 приувеличениях ×40, ×60, ×100, ×200, ×400 с фазовым контрастом для оценкиконтрольных лунок и визуализации клеток, находящихся по краю матрицы.2.8 Описание методики оценки цитотоксичностиОценку адгезии и пролиферации клеток на матрицах проводили сиспользованием тех же линейных фибробластов 3Т3 и С3Н и с той же плотностьюпосева как при оценке цитотоксичности. Для визуализации клеток применялидвойную окраску.Стоковый раствор красителей готовили следующим образом: 1,5 мгакридинового оранжевого и 5,0 мг этидиума бромида растворяли в 0,1 мл 95%этанола, затем добавляли 5 мл дистиллированной воды.
Рабочий растворкрасителей готовили из стокового путем растворения в 100х объеме PBS. Дляокрашивания, предварительно отмытые от среды для культивирования, образцызаливали рабочим раствором красителей на 5 минут.В результате происходило окрашивание акридиновым оранжевым живыхклеток, а этидиумом бромидом – мертвых клеток.Локализацию флуоресценции образцов матрикса фиксировали с помощьюлазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM-710 (Carl ZeissMicroscopy,Germany).Окрашенныеобразцыизчашекдляinvitroкультивирования переносились на стерильные чашки Петри с тонким стекляннымдном толщиной 0,16 мм в растворе PBS. Для получения изображенийиспользовалиобъективECPlan-Neofluar10x/0.3/М27.Возбуждениефлуоресцентного акридинового оранжевого производили лазером с длиной волны488 нм, регистрировали флуоресценцию в диапазоне 495÷545 нм.
Возбуждениефлуоресцентного этидиума бромида производили лазером с длиной волны 561 нм,регистрировали флуоресценцию в диапазоне 580÷690 нм. В результате получалиналожение флуоресцентных изображений локализаций акридинового оранжевого39(зеленый цвет), этидиума бромида (красный цвет) и изображения, полученного врежиме проходящего света.2.9 Морфологическая оценка изменений тканей в области имплантацииДля морфологического исследования образцы тканей фиксировали не менее48 ч в 10% растворе нейтрального забуференного формалина (Biovitrum, Россия),проводили через серию спиртов восходящей концентрации, заливали в парафин.Микротомные срезы толщиной 5-6 мкм тщательно депарафинировали иокрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону (длявыявления коллагена), фукселином по Унна (для выявления эластическихволокон), толуидиновым синим (для выявления кислых гликозаминогликанов).Изучение гистологических препаратов выполняли с помощью прямогосветового микроскопа исследовательского класса Olympus BX51 (Olympus, Japan),оснащенного цветной цифровой камерой SDU-252 («Спецтелетехника», Россия)при оптических увеличениях от 40× до 1000×.
Для оценки биосовместимостиимплантированных гибридных матриц изучали признаки периимплантационноговоспаления(отек,экссудацию,клеточнуюинфильтрацию,нарушениямикроциркуляции), а также проявления репаративной реакции (ангиогенез,пролиферацию фибробластов, распространенность и зрелость грануляционнойткани,характерискоростьинтеграцииимплантированныхматрицсрезидентными тканями), а также скорость биодеградации (резорбции матриц).Морфометриютканевыхэлементовпроводилисиспользованиемспециализированного модуля стандартного пакета программ Adobe Photoshop CS3по микрофотографиям препаратов с помощью предварительно определенныхгеометрических калибровочных коэффициентов, описывающих соответствиечисло пикселов изображения длине отрезка в микрометрах, для каждогоиспользуемого объектива.40Глава 3.
Результаты собственного исследования3.1 Описание полученной матрицы на основе децеллюризированнойартериальной стенкиМакроскопически сразу после децеллюляризациивыгляделаразрыхленной.ПримикроскопическомстенкаисследованииартерииДМТАСвыявлены коллагеновые волокна, которые окрашиваются фуксинофильно, чтосвидетельствует о сохранности молекулярной и супрамолекулярной структурыколлагена. В целом матрица представляла местами разрыхленный, местамиплотный (рис.7, а) коллагеновый каркас стенки артерии.
Клетки в артериальнойстенке отсутствовали, а из структур эластической сети частично сохранялисьлишь внутренняя и наружная эластические мембраны (черная стрелка) артерии иотдельные слабоокрашенные эластические волокна медии средней оболочки(красная стрелка) (рис. 7, б).Таким образом, матрица представляет собой бесклеточный коллаген-эластиновыйкаркас сосудистой стенки.Рисунок 7. Микропрепарат готовой матрицы ДМТАС. а — полностью децеллюляризированныйколлагеновый каркас артериальной стенки; эластические волокна также отсутствуют.
Комбинированнаяокраска по Ван-Гизону — Унна. × 200; б — сохранившиеся эластические мембраны (черная стрелка) ибледно окрашенные эластические волокна (красная стрелка). Окраска орсеином. × 200.413.2 Имплантация матрицы на основе децеллюризированной артериальнойстенки, биодеградация и биосовместимостьКак уже было сказано выше, крысы с имплантированной ДМТАС выведеныиз эксперимента на 7, 30, 60 и 90 сутки.
Все участки имплантации были безмакроскопических изменений. Участок имплантации иссекался острым путем,поиск участка производился по лигатурам пролен 4-0. Данные образцыподготовлены в соответствии с описанной в главе 2 методике.На 7-е сутки после имплантации в ДМТАС усиливалось разрыхлениеколлагеновых пучков вследствие отека ткани, на краях выявлялись мелкие очагивоспалительной инфильтрации (рис. 8, а). Соединительнотканная капсула вокругДМТАС к этому сроку еще не сформировывалась, но в окружающей тканиотмечалась слабая лимфомакрофагальная реакция с небольшой примесьюнейтрофильныхлейкоцитов.На30-есуткиотмечалосьформированиесоединительнотканных капсул вокруг ДМТАС, появлялись признаки частичнойбиодеградации наружных слоев имплантата (рис. 8, б), что выражалось вмакрофагальнойрезорбциинаружныхслоевимплантата(бывшейадвентициальной оболочки сосуда).К 60-м суткам продолжалась постепенная деструкция ДМТАС.
При этомоставался лишь тонкий фрагмент имплантата, инфильтрированного макрофагамии лимфоцитами (рис. 8, в), тогда как большая часть имплантата к этому временибыла резорбирована. На 90-е сутки почти во всех случаях наблюдалась полнаярезорбция имплантатов (рис. 8, г).42Рисунок 8. Микропрепарат матрицы ДМТАС (крысы). а — 7-е сутки после имплантации ДМТАС.Разрыхление коллагеновых пучков и очаги воспалительной инфильтрации.
Комбинированная окраска поВан-Гизону — Унна. × 200; б — 30-е сутки после имплантации. Матрица (1), окруженнаясоединительнотканной капсулой (2), между ними располагается зона деструкции матрицы макрофагами (3);в — 60-е сутки после имплантации. Большая часть матрикса (толстые стрелки) резорбирована и замещенагрануляционной тканью (тонкие стрелки). Окраска гематоксилином и эозином. × 200; г — полноеотсутствие матрицы через 90 сут после имплантации.
Нерассасывающиеся швы над областью фиксацииматриц. Макроснимок.Таким образом,обладаетморфологические исследования показывают, что матрицавысокойбиосовместимостью,длительнойбиорезорбцией,оканчивающейся после 60 суток.3.3 Результаты оценки структурно-функциональных свойств матрицы наоснове децеллюризированной артериальной стенкиРетроградную уретроцистографию по описанной выше методике выполнялипосле удаления уретрального катетера спустя 1, 3 и 6 мес после операции.Полученные уретрограммы сравнивали с предоперационной уретрограммой (рис.9, а).
На уретрограммах через 1 мес после операции хорошо видна зонаимплантацииДМТАС,затековконтрастноговеществанебыло(что43свидетельствует о полном приживлении матрицы), просвет уретры полностьюсохранен (рис. 9, б). В сроки 1 и 3 мес уретрограммы значимо не отличались другот друга. Через 6 мес после операции просвет уретры также сохранен, однакоотмечалось формирование дивертикула в зоне имплантации ДМТАС у одногокролика из 12 (рис. 9, в).Рисунок 9. Ретроградные уретро(цисто)граммы кролика.
а — до операции, уретра выделена фигурнойстрелкой; б — через 1 мес после операции, зоны анастомозов указаны стрелками; в — через 6 мес послеоперации, дивертикул (указан стрелкой).Самостоятельное мочеиспускание восстановилось у всех животных послеудаления катетера и сохранялось до конца наблюдения. Признаков облитерациипросвета уретры не обнаружено.44Вывод: в соответствии с представленными выше данными матрица на основедецеллюризированнойартериальнойстенкиобладаетхорошимифункциональными свойствами.
Однако, при длительном наблюдении все жеопределяются осложнения в виде формирования дивертикула на местеимлантации матрицы.3.4 Морфлогическая оценка результаты уретропластики с использованиемматрицы на основе децеллюризированной артериальной стенкиМорфологическое исследование показало, что ДМТАС представляет собойбесклеточный коллагеновый каркас артерии. Биодеградация ДМТАС к 10–30-мсуткам после операции незначительна и отмечалась только на торцах протеза. К30-м суткам вокруг имплантата формировалась соединительнотканная капсула,чаще всего отделенная небольшой щелью от его наружной поверхности.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
