Диссертация (1140130), страница 8
Текст из файла (страница 8)
К критериям исключения относили активность других42вирусов герпетической группы, отсутствие микробов-ассоциантов илиналичие их в количестве менее 105 КОЕ/мл.Анализ клинико-анамнестических особенностей ЭБВИ АсБ проводилиу 138 больных, исследование цитокинового статуса крови и слюны (IL-1β,RА IL-1β, IL- 4, IFNγ, IFNα) – у 97 пациентов дважды: при поступлении и впериоде реконвалесценции. Контрольную группу составили 25 детей I-IIaгруппы здоровья, проживающих в городе Ростове-на-Дону.Исследования диссертационной работы одобрены на заседаниилокального Этического комитета ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России.Анализ результатов обследования осуществляли с учетом возрастапациентов, формы тяжести и периода заболевания.В возрастной структуре (таблица 2.1) преобладали пациенты в возрастеот 3 до 7лет (96 человек; 69,6%) по сравнению с детьми 7-15 лет (42человека; 30,4%, р<0,05).
Анализ распределения по гендерному признакупоказал преобладание мальчиков (81 человек; 58,7%, р<0,05). Количестводевочек составляло 41,3% (57 человек).Таблица 2.1. Распределение больных ЭБВИ АсБ по возрасту и полуВозрастОт 3 до 7 летОт 7 до 15 летВсегоКоличествобольныхn9642138Пол%69,6±3,9* Мальчики30,4±3,9 Девочки100ВсегоКоличествобольныхn8157138%58,7±4,2**41,3±4,2100Примечание:*- достоверность различий показателей по возрасту;**- достоверность различий показателей по полу; p<0,05.На основании оценки местных и общих клинических проявленийопределяли форму тяжести заболевания (рисунок 2.1, таблица 2.2.).Среднетяжелая форма ЭБВИ АсБ имела место у 112 пациентов (81,2%),43которые составили первую группу.
В нее вошли 79 детей (70,5%) в возрастеот 3 до 7 лет, 33 больных (29,5%) в возрасте от 7 до 15 лет.Рис. 2.1. Распределение больных с учетом формы тяжести ЭБВИ АсБВторую группу составили 26 пациентов (18,8%) с тяжелой формой ЭБВИАсБ, из них к возрастной группе от 3 до 7 лет относились 17 человек (65,4%),от 7 до 15 лет – 9 человек (34,6%). Дети с легкой формой заболевания вотделение не поступали. Возрастной состав детей от 3 до 7 лет (таблица 2.2)преобладал в обеих группах (р<0,05).Таблица 2.2.
Распределение с учетом возраста пациентови формы тяжести ЭБВИ АсБВозрастОт 3 до 7 летОт 7 до 15 летВсегоФорма тяжестиСреднетяжелаяТяжелаяn%n%7970,5±4,31765,4±9,53329,5±4,3*934,6±9,5*112100,026100,0Итогоn9642138%69,6±3,930,4±3,9*100,0Примечание: *- достоверность различий показателей у больных в возрасте от 3до 7 и от 7 до 15 летАнализ микробного пейзажа слизистой ротоглотки (рисунок 2.2) уобследованных больных выявил наличие как одного, так и одновременнонесколькихассоциантоввразличнойкомбинации.Чащевыделялимонокультуры (у 109 человек; 79,1%), из которых наиболее частымимикробами-ассоциантами выступали стрептококки, именно S. pyogenes -4434,1% и S.
viridans – 23,9%. У одного ребенка в мазке со слизистойротоглотки обнаружен S. pneumonia (0,7%). Наличие C. аlbicans отмечали у 6обследованных больных (4,4%). Микробные ассоциации обнаруживали у 29больных(20,9%).Причемчащеонивстречалисьвсочетаниисострептококками (в 7,9% с S. pyogenes, в 10,9% с S. viridans).S. pneumoniaeC.
albicansS. epidermidisS. aureusS. viridansS. pyogenes0монокультура51015202530S. pyogenes34,1S. viridans23,9S. aureus10,9S. epidermidis5,17,910,91,40,7микробные ассоциации3540C. albicans4,445%S. pneumoniae0,7Рис. 2.2. Микробный пейзаж слизистой оболочки ротоглотки больныхЭБВИ АсБНаблюдениезадетьми,котороевключалообщеклинические,иммунологические, бактериологические методы исследования, осуществлялив острый период и фазу ранней реконвалесценции. Полученные результатыфиксировали в специально разработанные карты обследования пациентов иэлектронный журнал.2.2.Методы исследования2.2.1.Общеклинические методыОбследование включало сбор анамнестических данных, физикальныйосмотр, общий анализ крови и мочи, по показаниям биохимическое45исследование крови (общий белок и его фракции, глюкоза, мочевина, Среактивный белок, билирубин и его фракции, активность АЛаТ, АСаТ и др.),инструментальные методы исследования (УЗИ органов брюшной полости,рентгенографияоргановгруднойклетки,компьютернаятомографияверхнечелюстных пазух носа и др.).
При необходимости привлекали узкихспециалистов (оториноларинголога, кардиолога, невролога, иммунолога,хирурга и др.). Для установления этиологической структуры заболеванияметодом полимеразной цепной реакции исследовали кровь на наличие ДНКвирусовпростогогерпеса1,2типов,Эпштейна-Баррвируса,цитомегаловируса; с помощью иммуноферментного анализа в сывороткекрови определяли антитела класса М к капсидному антигену (VCA), класса G– краннему (EA), нуклеарному (EBNA) и мембранному (MA) антигенам ЭБВ,а также IgM, IgG с определением индекса авидности к ВПГ1,2, ЦМВ спомощьюсоответствующихтест-системЗАО«Вектор-Бест»(г.Новосибирск).2.2.2.
Исследование концентрации сывороточных и саливарныхцитокиновИсследованиеконцентрацииинтерлейкина-1бета(ИЛ-1β),рецепторного антагониста интерлейкина-1 бета (РА ИЛ-1β), интерлейкина-4(ИЛ-4), интерферона гамма (ИФНγ), интерферона альфа (ИФНα) проводили сприменениемиммуноферментныхтест-системЗАО«Вектор-бест»(Новосибирск) на автоматическом спектрофотометре для учета результатовисследования в ИФА (модель «Labsystems Multiscan M Sversion3.0»,Финляндия). Измерение проводили твердофазным иммуноферментнымметодом с помощью моноклональных антител и с применением пероксидазыхрена в соответствии с прилагаемыми инструкциями. По результатамоптическойплотностититрованныхстандартныхобразцовстроиликалибровочные графики для каждого из цитокинов, по которым определяликонцентрацию ИЛ-1β, РА ИЛ-1β, ИЛ-4, ИФНγ, ИФНα в опытных образцах46сыворотки крови и слюны.
Исследование содержания ИЛ-4, ИФНγ, ИФНα у97 пациентов двукратно проводили в двух биологических жидкостях(сыворотка крови, слюна), ИЛ-1β, РА ИЛ-1β только в сыворотке крови.Забор крови для исследований производили из локтевой вены утромнатощаквпластмассовуюпробирку.Затемпробиркускровьюцентрифугировали в течение 15 минут при скорости 3000 оборотов в минуту.Отделившуюся сыворотку отбирали автоматическими пипетками-дозаторамии помещали в пробирки типа «эппендорф», которые помещались вморозильную камеру на хранение при температуре -400С.Сборслюныдляанализавыполнялсяутромнатощакпослепредварительного полоскания ротовой полости 0,9 % раствором натрияхлорида путем сплевывания в пластиковый контейнер в течении несколькихминут.
Затем слюна центрифугировалась при скорости 3000 об/мин в течение15минут.Образовавшуюсянадосадочнуюжидкостьотбиралиавтоматическими пипептками-дозаторами и помещали в пробирки типа«эппендорф», которые помещались в морозильную камеру на хранение притемпературе -400С.2.2.3. Бактериологические методыДля определения патогенетического влияния микрофлоры ротоглоткина состояние больных инфекционным мононуклеозом ЭБВ этиологииизучали биологические свойства возбудителей.Дляисследованияиспользовалиштаммымикробов-ассоциантов(S. pyogenes, S.
viridans, S. aureus, S. epidermidis, P. aeruginosa), выделенные вдиагностически значимом количестве (≥105 КОЕ/мл) со слизистой ротоглоткидетей в возрасте от 3 до 15 летс диагнозом «Мононуклеоз, вызванныйвирусом Эпштейна-Барр».47Забор отделяемого со слизистой оболочки ротоглотки для выделения иидентификациипредставителеймикрофлорыбольныхпроводиливсоответствии с приказом № 535 [118].Ферментативные свойства выделенных штаммов изучали путемопределения фермента ДНК-азы. Определяли ДНК-азную активностьбактерий (S.
pyogenes, S. viridans, S. aureus, S. epidermidis, P. aeruginosa) спомощью специальной питательной среды – агара для теста на ДНК-азу столуидиновым синим (производство фирмы «Hi Media Laboratories Pvt.LTD», Индия), визуализирующий продукцию искомого фермента. Посевпроводили бляшками диаметром 0,6-0,7 мм на плотную поверхность среды споследующим термостатированием при +370С 24 часа и при +220С 48 часов.Наличие и активность ДНК-азы оценивали по диаметру зоны измененияцвета среды вокруг сформированной бляшки: более 6 мм – высокая, от 2 до 6мм – средняя, до 2 мм – низкая.2.2.4. Влияние микробов-ассоциантов на клетки иммуннойсистемыАпоптогеннуюактивностьS.
pyogenes,S. viridans,S. aureus,S. epidermidis, P. aeruginosae в отношении перитонеальных макрофаговмышейопределялипоопределеннойметодике[141]. Исследованиепроводили на белых беспородных мышах (18-20г) из питомника ФКУЗ«Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт»Роспотребнадзора.Умерщвлениеживотныхосуществлялиметодомцервикальной дислокации после предварительной наркотизации с помощьютиопентала натрия в дозе 5 мг/кг. Объектом исследования послужилиперитонеальные макрофаги мышей. Клетки выделяли через 4 часа послевнутрибрюшинного введения 1% пептонной воды рН 7,2 (2 мл), вызвавшегоасептическое воспаление.
Макрофаги получали через четверо суток послевведения пептона. Взятие клеток проводили промыванием брюшной полости48животных средой 199 (10 мл), содержащей 5 ед/мл гепарина, 20%инактивированной при +560 С в течение 30 мин. сыворотки крови человека ипенициллин – 100 ед/мл. Полученный экссудат смешивали со взвесямиисследуемых штаммов микробов-ассоциантов густотой 5 КОЕ (500 млн.м.т/мл) в разведениях 1:10 и 1:100 (0,1 мл) и подслаивали под покровноестекло, вложенное в стерильный пенициллиновый флакон. Флаконы, вкоторых покровные стекла находились на внутренней верхней стенке,инкубировали при +370 С в течение часа.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
