Диссертация (1139676), страница 41
Текст из файла (страница 41)
Фактор индукции SOSответа для изучаемого соединения в концентрации от 50 до 1000 мкг/мл был нижепорогового значения (таблица 9.7).Таблица 9.7. SOS-индуцирующая активность амида 43DИсследуемоесоединениеДоза,β-галактозидаза,Щелочная фосфатаза,Фактормкг/млпоказательпоказательиндукцииактивностиактивностиSOSответа (IF)1Негативный2345-327,6±36,5993,1±39,5-102107,2±70,91775,6±93,17,02контрольМитомицин С287143DРезультаты,234550297,1±72,81019,5±44,10,9500279,1±37,8855,2±47,60,91000276,3±45,4954,2±57,20,9полученныевSOS-хромотесте,позволяютразделитьисследуемые соединения по типу воздействия на геном микроорганизмов.Производные замещенных 5-аминоиндолов, амиды 66D и 43D не обладают SOSиндуцирующей способностью в исследуемых концентрациях (рисунок 9.1).Циклический амид 5D, соединение на основе 4-амино-2-фенилиндола, вконцентрации оказывало дозозависимый эффект на активность индуцибельногофермента β-галактозидазы тестерного штамма E.coli PQ 37.
Соединения, наоснове замещенных 6-аминоиндолов – 7D и 7-аминоиндолов – HD и 4D, также вконцентрации 50 мкг/мл не демонстрировали индукцию SOS-функций утестерного штамма кишечной палочки, а в более высоких концентрациях,являющихся бактерицидными, проявляли SOS-индуцирующую активность, чтосвидетельствует о влиянии на ДНК прокариотической клетки данных соединений.Исходя из доказанного бактериостатического типа действия в МПКисследуемых соединений, можно предположить, что воздействие на клеточнуюстенку и цитоплазматическую мембрану микроорганизмов, что имеет следствиемгибель микробной клетки, не является механизмом противомикробного действиягруппы изучаемых производных 4-, 5-, 6-, 7-аминоиндолов.
В концентрациях 50 и500 мкг/мл исследуемые соединения не вызывали индукцию SOS-ответамикробной клетки, но в высоких концентрациях (1000 мкг/мл), соединения сширокимспектромдозозависимыйпротивомикробногоSOS-индуцирующийэффект.действияРанеедемонстрировалипоказано,чтоприисследовании выше указанных соединений в тесте Эймса установлено, что ниодно из изученных соединений не обладает в данном диапазоне концентраций (от10 до 1000 мкг/мл) ни прямым токсическим действием, ни мутагеннойактивностью по отношению к тестерному штамму S.typhimurium ТА 100.288Фактор индукции SOS-ответа (IF)8*76*54****3210Исследуемые соединенияРисунок 9.1 – Показатели фактора индукции SOS-ответа исследуемых соединений289Таким образом, проведенное исследование позволяет заключить, чтомеханизм действия исследуемых соединений включает воздействие на ДНКмикробнойклетки.Ввысокихконцентрацияхсоединенияпроизводныезамещенных 4-, 6-, 7-аминоиндолов способны оказывать воздействие на ДНКпрокариотических микроорганизмов, в бактериостатических концентрациях,выше указанные соединения и производные замещенных 5- аминоиндолов,возможно имеют дополнительный механизм.290ГЛАВА 10.
ИССЛЕДОВАНИЕ ТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВСОЕДИНЕНИЙ НА ОСНОВЕ ЗАМЕЩЕННЫХ 4-, 6-, 7-АМИНОИНДОЛОВНА ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ ИПРОКАРИОТИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ IN VITRO10.1. Цитотоксичность исследуемых соединений in vitroИзучена цитотоксичность препаратов c лабораторными шифрами 5D, НD,S3 и 7D in vitro на линии опухолевых клеток HeLa (ATCC ® CCL-2TM).Исследуемые соединения 5D, НD, S3 и 7D тестировали в диапазонеконцентраций 50-1000 мкг/мл в четырех параллельных сравнениях (для каждойконцентрации) в 4 сериях экспериментов.
Среднее значение для четырех измеренийоптической плотности в опытных и контрольных лунках (эквивалент долиметаболически активных/жизнеспособных клеток) выражали в процентах кконтролю [129].МТТ-тест показал, что при применении амида 5D в диапазоне концентрацийот 1000 до 50 мкг/мл доля жизнеспособных клеток по отношению к контролюколебалась в пределах 96,1±3,8 % до 89,2±1,5 % соответственно (таблица 10.1;рисунок 10.1). На фоне введения в культуру опухолевых клеток циклическогоамида НD в аналогичных концентрациях жизнеспособность клеток существенноне изменялась, процент жизнеспособности находился в пределах от 85,1±3,8 % до70,4±1,3 %, что статистически не отличалось от контроля. Показательжизнеспособности клеток аденокарциномы шейки матки человека в присутствииамида S3, добавленного в культуральную среду в дозе 1000 мкг/мл составил89,3±3,1 %, в дозе 500 мкг/мл – 92,2±4,4 % и в дозе 50 мкг/мл – 95,7±3,4 %, чтоподтверждает отсутствие цитотоксического действия in vitro.291Таблица 10.1 – Выживаемость линии опухолевых клеток HeLa на фонеприменения исследуемых соединений (МТТ-тест)Исследуемые соединенияДозасоединения,мкг/млНD5DS37DДоля жизнеспособных клеток по отношению к контролю, %100089,2±1,570,4±1,389,3±3,1112,2±2,650092,5±3,271,2±7,592,2±4,4109,5±2,45096,1±3,885,1±3,895,7±3,4106,2±3,5Примечание: * - отличие от контроля статистически достоверно при Р<0,05;Выживаемость линии опухолевыхклеток, %выживаемость культуры клеток в контроле составляет 100 %.1201008060402001000 мкг/мл1500 мкг/мл250 мкг/мл3Доза исследуемого соединенияКонтроль5DHDS37DРисунок 10.1 – Динамика выживаемости линии опухолевых клеток HeLa нафоне применения исследуемых соединений (МТТ-тест)В ходе эксперимента было выявлено, что соединение 7D усиливаютпролиферацию исследуемой тест-культуры, показатель выживаемости линии292опухолевых клеток HeLa на его фоне превышает этот показатель в контроле.
Такв дозе 1000 мкг/мл доля жизнеспособных клеток по отношению к контролюсоставила 112,2±2,6 %, в дозе 50 мкг/мл –109,5±2,4 % и в дозе 50 мкг/мл –106,2±3,5 %.В ходе эксперимента выявлено, что исследуемые соединения 5D, НD, S3,7Dнеобладаютспособностьюоказыватьтоксическоевоздействиенаэукариотические клетки аденокарциномы шейки матки человека при инкубации вприсутствии исследуемых концентраций в течении 48 часов.В результате исследования выявилась тенденция к увеличению количестваметаболически активных клеток при инкубировании в присутствии циклическогоамида 7D, что может свидетельствовать о возможном митогенном эффектеисследуемого соединения.Таким образом, все изучаемые соединения в исследуемом интервалеконцентраций не обладают способностью оказывать цитотоксическое воздействиена эукариотические клетки аденокарциномы шейки матки человека.10.2.
Исследование генотоксических эффектов исследуемых соединенийin vitroДиапазон концентраций, приемлемых для использования в тесте Эймса,определен в процессе оценки токсичности исследуемых соединений поотношению к штамму S.typhimurium ТА 100. Среднее число колониеобразующихединиц (КОЕ) штамма S.typhimurium TA 100 на чашках с питательной средойсоставило197,7.Придобавлениикпитательнойсредеисследуемогоциклического амида с лабораторным шифром 7D в дозе 50 мкг/мл среднее числоКОЕ тест-штамма сальмонеллы составило 196,7, в дозе 500 мкг/мл – 196,7 и вдозе 1000 мкг/мл – 121,7.
Таким образом, средняя выживаемость штаммаS.typhimurium TA 100 при добавлении исследуемого соединения оказалась >50%,так как при добавлении 50 мкг/мл соединения 7D средняя выживаемостьсоставляла 99,3 %, 500 мкг/мл – 99,3 % и 1000 мкг/ мл – 61,45 %.
Соединение с293лабораторным шифром 7D не показало токсических эффектов ни в одной изисследуемых концентраций (таблица 10.2).При исследовании амида 5D наблюдалась следующая динамика. Среднеечисло колониеобразующих единиц (КОЕ) штамма S.typhimurium TA 100 начашках с питательной средой с добавлением исследуемого соединения 5D в дозе50 мкг/мл составило 196, в дозе 500 мкг/мл – 180,7 и в дозе 1000 мкг/ мл – 138,7.Средняя выживаемость ауксотрофного штамма S.typhimurium составила 98,99 %,91,25 % и 70,03 % соответственно для исследуемых концентраций.
Соединение слабораторным шифром 5D не показало токсических эффектов ни в одной изисследуемых концентраций.При добавлении к питательной среде исследуемого амида с лабораторнымшифром S3 в дозе 50 мкг/мл среднее число КОЕ штамма S.typhimurium TA 100составило 189,3, в дозе 500 мкг/мл – 170 и в дозе 1000 мкг/мл – 159. Такимобразом, средняя выживаемость исследуемого штамма сальмонеллы придобавлении исследуемого соединения оказалась >50 %, так как при добавлении 50мкг/мл соединения S3 средняя выживаемость штамма S.typhimurium составляла95,62 %, 500 мкг/мл – 85,86 % и 1000 мкг/ мл – 80,3 %.
Соединение S3 не показалотоксических эффектов ни в одной из исследуемых концентраций.Таблица 10.2 – Токсичность исследуемых соединений по отношению кштамму S.typhimurium ТА 100ИсследуемоесоединениеДоза,мкг/мл1Контроль7D2Среднее числомикроорганизмов,КОЕ/чашка3Средняявыживаемостьштамма, %4-197,710050196,7±2,1099,33500196,7±8,4799,331000121,7±4,5861,4529415DS3HD23450196±7,0798,99500180, 7±1,5491,251000138, 7±1,5470,0350189,3±3,0995,62500170±4,6385,861000159±1,5280,3050150±3,6475,76500140,7±8,1671,041000143±11,4472,22Добавление к питательной среде для культивирования ауксотрофногоштамма S.typhimurium исследуемого циклического амида с лабораторнымшифром HD не показало токсических эффектов ни в одной из исследуемыхконцентраций.
Так при добавлении изучаемого соединения НD в дозе 50 мкг/млна чашках наблюдалось в среднем 150 КОЕ штамма S.typhimurium TA 100, в дозе500 мкг/мл – 140,7 КОЕ и в дозе 1000 мкг/ мл – 143 КОЕ. Средняя выживаемостьисследуемого штамма составила 75,76 %, 71,04 % и 72,22 % соответственно прииспользовании50мкг/мл,500мкг/мл1000мкг/млсоединенияНD.Соответственно показатели средней выживаемости оказались >50 %.Результаты, полученные при оценке токсичности исследуемых соединенийв концентрациях 50, 500, 1000 мкг/чашка, свидетельствуют о том, что в данномдиапазоне концентраций соединения с лабораторными шифрами 7D, 5D, S3, HDне вызывают существенного угнетения роста (более 50%) тест-штамма SalmonellatyphimuriumTA100.Этоконцентраций в тесте Эймса.позволилоиспользоватьуказанныйдиапазон29510.3. Способность исследуемых соединений к индукции генных мутацийСреднее число колоний His+ревертантов на питательной среде, содержащей10 мкг азида натрия (положительный контроль), составило 511,3±19,73.
Среднеечисло колоний His+ревертантов на питательной среде, содержащей ДМСО(отрицательный контроль), составило 83,3±5,7. При добавлении к питательнойсреде исследуемого циклического амида с лабораторным шифром 7D в дозе 50мкг/мл среднее число КОЕ His+ревертантов сальмонеллы составило 154,3±2,52, вдозе 500 мкг/мл – 154,7±3,21 и в дозе 1000 мкг/ мл – 156,7±3,51. Таким образом,число колоний-ревертантов штамма S.typhimurium TA 100 при добавленииисследуемого соединения не превышало в 2 раза число колоний-ревертантов внегативном контроле, так как при добавлении 50 мкг/мл соединения 7D индексмутагенноcти составил 1,85, 500 мкг/мл – 1,86 и 1000 мкг/ мл – 1,88.
Соединение слабораторным шифром 7D не показало мутагенной активности ни в одной изисследуемых концентраций (таблица 10.3).При исследовании амида 5D наблюдалась следующая динамика. Среднеечисло КОЕ His+ревертантов штамма S.typhimurium TA 100 на чашках спитательной средой с добавлением исследуемого соединения 5D в дозе 50 мкг/млсоставило 116,3±8,02, в дозе 500 мкг/мл – 122,7±5,51 и в дозе 1000 мкг/мл –124±3,61. Индекс мутагенности амида 5D по отношению к ауксотрофномуштамму S.typhimurium составил 1,4, 1,47 и 1,49 соответственно для исследуемыхконцентраций. Соединение с лабораторным шифром 5D не показало мутагеннойактивности в исследуемом диапазоне концентраций.При добавлении к питательной среде исследуемого амида с лабораторнымшифром S3 в дозе 50 мкг/мл среднее число КОЕ-ревертантов штаммаS.typhimurium TA 100 составило 116,7±4,5, в дозе 500 мкг/мл – 139,7±6,66 и в дозе1000 мкг/ мл – 156±2,65.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
