Диссертация (1139676), страница 38
Текст из файла (страница 38)
Запоздалыйрост микроорганизмов свидетельствует о способности соединений, полученныхна основе 4-, 6- и 7-замещенных аминоиндолов задерживать рост и размножениемикроорганизмов и оказывать в МПК бактериостатическое действие.266ГЛАВА 8. НОВЫЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИПАПРОТИВОМИКРОБНОГО ДЕЙСТВИЯ СОЕДИНЕНИЙ, ОБЛАДАЮЩИХАНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТЬЮИсследование противомикробной активности новых соединений включаеткак традиционное изучение минимальной подавляющей концентрации (МПК)вещества, так и других показателей, одним из которых является определение типадействия (бактерицидное или бактериостатическое) [117]. Исследователи новыхпротивомикробных соединений сталкиваются с различными проблемами на этомпути – рутинность и длительность исторически сложившихся классическихметодик, дороговизна питательных сред, одноразовой лабораторной посуды,недоступность традиционно применяемой аппаратуры и диагностических системдля исследований новых соединений.
Классические методы определения типапротивомикробного действия включают длительные периоды наблюдения от 5сут и более, большие затраты исследуемых соединений и питательных сред [87].Современные методы основаны на исследовании и сравнении МПК иминимальных бактерицидных концентраций (МБК). Данные показатели даютвозможность условно классифицировать новое соединение по типу действия набактериальную клетку [117].Недостатками известного решения являются затраты большого количестваиспытуемого препарата, питательной дорогостоящей среды (МХБ), лабораторнойпосуды и необходимость наблюдения в течение 5-7 сут.
Результат оценивается спомощью невооруженного глаза, что не прибавляет точности в исследовании,либо с последующим использованием чашек Петри с МХА, также дорогостоящейпитательной средой, для высева микроорганизмов и инкубирования в течение 1820 ч, а это прибавляет еще сутки к проводимому эксперименту.Новыйспособопределенияпротивомикробногодействия(бактериостатическое или бактерицидное) основан на вычислении коэффициентаоптическойплотностикультуральнойсредывходекультивированиямикроорганизмов с противомикробными соединениями в жидкой питательной267среде.
Преимущества способа заключаются в быстром и качественномопределениитипапротивомикробногодействиябиологическиактивныхсоединений, использование небольшого количества питательной среды придостаточно коротком временном интервале, составляющем 24 ч [466].Новизна способа состоит в разработке опытным путем формулы расчета иопределении показателей коэффициента оптической плотности культуральнойсреды, соотносящиеся с бактериостатическим типом действия и бактерициднымтипом действия исследуемых соединений.Способ определения типа противомикробного действия новых соединений,обладающих антимикробной активностью, включает проведение исследованияоптической плотности культуральной жидкости в объеме 1 мл в стерильныхкюветах при длине волны 600 нм, далее зависимость оптической плотностинового соединения со штаммом бактерий Staphylococcus aureus 6538-P обнуляетсяпо показателям оптической плотности исследуемого соединения.
Определяетсяоптическая плотность культуральной среды в присутствии штамма бактерийStaphylococcus aureus 6538-P, культивируемого при МПК в объеме 1 мл и придвух-, четырех- и шестикратном увеличении МПК исследуемого соединения.Определяется оптическая плотность культуральной среды с исследуемыммикроорганизмом при культивировании без исследуемого соединения. На основеполученных показателей вычисляется коэффициент оптической плотностикультуральной среды по формуле (1):KD =D1 + D2 + D3 …+ Dn×100,n(1)где КD – коэффициент оптической плотности культуральной среды,D – оптическая плотность культуральной жидкости при культивированиимикроорганизмов в присутствии различных концентраций противомикробногосоединения,n – количество исследованных концентраций соединения.268Показатель КD с исследуемым соединением более 1 свидетельствует, чтоисследуемое соединение обладает бактериостатическим типом действия вотношении исследуемого микроорганизма, если менее 1 – исследуемоесоединение обладает бактерицидным типом действия в отношении исследуемогомикроорганизма.В основу нового способа определения типа противомикробного действияновых соединений, положено следующее обоснование:Оптический метод изучения биомассы для количественного подсчетамикроорганизмовпозволяетдостаточнобыстроиточноопределитьконцентрацию клеток в культуральной жидкости.
В его основе лежит измерениеослабления пучка света при его прохождении через суспензию клеток. Вопределенных пределах оно обусловлено преимущественно рассеянием светаклетками и пропорционально их концентрации. Величина этого показателязависит от многих факторов: формы клеток, размера микроорганизмов,оптических свойств самой культуральной среды, длины световой волны и т. д.Поэтому способ имеет ограничения и пригоден лишь для тех микроорганизмов,которые вызывают равномерное помутнение питательной среды, и их рост несопровождается образованием мицелия, пленок или других постороннихсоединений. Очень важно чтобы среда для культивирования была оптическипрозрачной.Бактерицидныепрепаратынепозволяютразмножатьсячувствительным микроорганизмам, и их концентрация в культуральной средемало отличается от таковой в «отрицательном контроле» (пробирка смикроорганизмами, которую помещают в холодильник при температуре 4 °С, приданнойтемпературеБактериостатическиеростпрепаратымикроорганизмовзадерживаютростненаблюдается).иразмножениечувствительных микроорганизмов и в культуральной среде при наличии МПКпрепаратов наблюдается изменение концентрации микроорганизмов.
Выявлено,что оптическая плотность культуральной среды «отрицательного контроля»Staphylococcus aureus 6538-P АТСС составляет 0,003, а видимый рост269микроорганизмовнаблюдаетсяприпоказателяхоптическойплотностикультуральной среды более 0,21.Способ разработан на основании исследования, в которое было включено 2музейных штамма микроорганизмов (Streptococcus pyogenes 19615 АТСС иStaphylococcus aureus 6538-P АТСС) и апробирован, как на традиционныхантимикробных препаратах с доказанным бактерицидным и бактериостатическимтипом действия, так и на группе новых соединений, синтезированных на основезамещенных 4-, 5-, 6-, 7-аминоиндолов, обладающих противомикробнымдействием [3; 125; 126; 127; 128; 131; 185; 465].
В качестве традиционныхпротивомикробных средств использовались бактерицидные – ампициллин ицефазолин, и бактериостатические – азитромицин и линкомицин [98].В качестве тест-микроорганизмов для изучения типа противомикробногодействияисследуемыхсоединенийиспользовалисьмузейныештаммыStreptococcus pyogenes 19615 АТСС и Staphylococcus aureus 6538-P АТСС.Для изучения типа противомикробного действия новые исследуемыесоединенияиспользовалисьввидераствора(вкачестверастворителяиспользовался «Димексид»). Группа исследуемых соединений включала амиды,циклические амиды и пирролохинолон, полученные на основе 4-, 5-, 6- и 7аминоиндолов:1.
Производное замещенного 4-амино-2-фенилиндола: 4-гидрокси-8-фенил4-(трифторметил)-1,3,4,7-тетрагидро-2Н-пирроло[2,3-h]хинолин-2-он(лабораторный шифр 5D).2. Производное замещенного 5-аминоиндола: 1,5-диметил-2-фенил-8(трифторметил)-1,5-дигидро-6Н-пирроло-[2,3-g]хинолин-6-он(лабораторныйшифр 39D).3. Производные замещенных 6-аминоиндолов: N-(1,5-диметил-2-фенил-1Ниндол-6-ил)-4,4,4-трифтор-3-оксобутанамид (лабораторный шифр S3) и 9гидрокси-5-метил-2-фенил-9-(трифторметил)-1,6,8,9-тетрагидро-7Н-пирроло[2,3f]хинолин-7-он (лабораторный шифр 7D).2704. Производное замещенного 7-аминоиндола: 6-гидрокси-2,3-диметил-6(трифторметил)-1,6,7,9-тетрагидро-8H-пирроло[3,2-h]хинолин-8-он(лабораторный шифр HD).Вкачестветрадиционных,использовалисьбактерицидныепротивомикробные препараты – ампициллин и цефазолин, и бактериостатические– азитромицин и линкомицин.
Использовались МПК исследуемых соединений иих двух-, четырех- и шестикратное увеличение. МПК исследуемых соединенийготовили в объеме 1 мл. Выбор исследуемых микроорганизмов осуществляетсяисходя из спектра противомикробного действия соединения.Концентрация суспензии исследуемого микроорганизма составляет 1,5×108КОЕ/мл. Оптическая плотность бактериальной суспензии с концентрацией1,5×108 КОЕ/мл при визуальном контроле соответствует стандарту мутности 0,5поМак-Фарланду.Использовалсякоммерческийстандартмутности.Бактериальная суспензия готовится из агаровых культур.
Для приготовленияинокулюма используется чистая суточная культура микроорганизмов, выросшихна плотных питательных средах. Отбирается несколько однотипных, четкоизолированных колоний, выросших на неселективных плотных питательныхсредах. Петлей переносится незначительное количество материала с верхушекколоний в пробирку со стерильным физиологическим раствором, плотностьинокулюма доводится точно до 0,5 по стандарту Мак-Фарланда. Инокулюмиспользуется в течение 15 мин после приготовления. МХБ, как для определениячувствительности к противомикробным препаратам [81], разливается по 0,5 мл вкаждую пробирку.
Количество пробирок составляет пять штук, в том числе, однадля постановки «отрицательного» контроля. Рабочий раствор исследуемогосоединения готовится из основного раствора с использованием жидкойпитательной среды – МХБ. Затем рабочий раствор в количестве 0,5 мл припомощи микропипетки со стерильным наконечником вносится в первуюпробирку, содержащую 0,5 мл бульона.
Тщательно перемешивается и новымстерильным наконечником переносится 0,5 мл раствора исследуемого соединенияв бульоне во вторую пробирку, содержавшую первоначально 0,5 мл бульона. Эту271процедуру повторяется, пока не приготовится весь необходимый ряд разведений.Из последней пробирки 0,5 мл бульона удаляется.
Таким образом, получается рядпробирок с растворами исследуемого соединения, концентрации которыхотличаются в соседних пробирках в 2 раза. Затем засевается культуройисследуемого микроорганизма. Конечная концентрация микроорганизма в каждойпробирке составляет примерно 5×105 КОЕ/мл. Все пробирки, кроме пробирки«отрицательный» контроль, инкубируются в обычной атмосфере при температуре37 °С в течение 16-20 или 20-24 ч (в зависимости от вида тестируемогомикроорганизма).Пробирка«отрицательный»контрольпомещаетсявхолодильник при температуре 4 °С, где хранится до учета результатов.Дляисследованияиспользовалсяоптическойплотностифотоэлектроколориметркультуральной(ФЭК)среды«AP-101».ApelФотоэлектроколориметрически исследуется оптическая плотность МХБ, МХБ сисследуемыми культурами микроорганизмов после инкубации при температуре37 °С в течение 24 ч (положительный контроль); МХБ с исследуемымикультурами микроорганизмов, который после посева помещались в холодильникпри температуре 4 °С, где хранились до учета результатов («отрицательныйконтроль»); МХБ с МПК исследуемых соединений без микроорганизмов; МХБ сМПК исследуемых соединений и исследуемыми культурами микроорганизмовпосле инкубации при температуре 37 °С в течение 24 ч.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
