Диссертация (1139676), страница 22
Текст из файла (страница 22)
Затем 12-ти часовая культура микроорганизмовразводится в изотоническом растворе и по 0,1 мл бактериальной суспензиивносится в пробирки с 3 мл растопленного 0,6 % LВ-среды агаризованной(конечная концентрация 10-7 КОЕ/мл) и 0,1 мл раствора исследуемого соединенияв различных концентрациях. Полученный раствор перемешивается и наслаиваетсяна 2% LВ-среду агаризованную в чашки Петри. Для негативного контроля вместоисследуемого соединения добавляется 0,1 мл растворителя (ДМСО). Посевыинкубируются в течение 24 ч при 37 °С. Затем подсчитывается число колонийвыросших (КОЕ) на опытных и контрольных чашках Петри.
Для оценкитоксичности исследуемых соединений используется критерий «выживаемость»формула (1):Вы иваемостьисло КОЕ ча ка в опытеисло КОЕ ча ка в контролеИзвестно, что исследуемые образцы считаются нетоксичными, есливыживаемость бактерий при их воздействии составляет ≥ 50% [355].2.7.2.
Полуколичественный метод учета генных мутаций(тест Эймса)Тест Эймса позволяет оценить мутагенный потенциал исследуемыхфакторов по индукции генных мутаций в специальных тест-штаммах. Всеисследованные Эймсом тест-штаммы получены из S.typhimurium дикого типа LT2[355]. В настоящей работе использовались ауксотрофные по гистидину, за счетточечной мутации в гистидиновом опероне, штаммы Salmonella typhimuium,122которые под действием мутагенов способны ревертировать к прототрофностипутем замены пар оснований. Мутационные реверсии гена uvr B приводит кнарушениям в процессе эксцизионной репарации.
При rfa мутации происходятнарушениявсинтезелипополисахаридов,чтоприводиткповышениюпроницаемости клеточной стенки и облегчению проникновения мутагена. Тестштамм также имеют плазмиду устойчивости к ампицилину рКМ 101, имеющую всвоем составе ген umu C, что увеличивает вклад ошибочной репарации в процессмутагенеза и, следовательно, чувствительность штамма [186].В тесте используются избирательные среды, на которых способны раститолько прототрофные по гистидину мутанты данных штаммов.
Мутационныеизменения без внешних воздействий происходят достаточно редко. Добавлениеже в селективную среду мутагена увеличивает частоту возникновения мутаций,что регистрируется по увеличению числа колоний мутантов (His+ ревертантов),выросших на используемой избирательной среде.Чистая культура тест-штамма Salmonella typhimurium ТА100 со скошенногоагара (LB-среда агаризованная) переносится в 5 мл LB-бульона c ампициллином(50 мкг/мл) и культивируется при 37 °С 24 часа. В день проведения исследования5 мл «ночной» культуры переносится в 20 мл свежего LB-бульона cампициллином (50 мкг/мл) и культивируется при 37 °С в течение 2-2,5 ч додостижения экспоненциальной фазы роста (плотность суспензии 1-2×109КОЕ/мл). Затем культуру переносится в стерильные центрифужные пробирки ицентрифугирется 20 мин при 5000 об/мин.
Полученный осадок ресуспендируетсяв растворе солевого концентрата, разведенного 1:4. По 3 мл 0,6 % верхнего агара смикродобавками биотина и гистидина разливается в пробирки и ставится наводяную баню при температуре 45 °С. В стерильные чашки Петри разливаетсянижний агар. В верхний агар вносятся по 0,1 мл бактериальной суспензии и 0,1 млраствора исследуемого соединения разной концентрации, все перемешивается, инаслаивается на нижний избирательный агар. Для негативного контроля в слойверхнего агара добавляетсяи 0,1 мл растворителя (ДМСО). В позитивныйконтроль вносится 0,1 мл раствора мутагена – азида натрия (10 мкг/чашка).123Чашки с посевами, после полного застывания агара, инкубируются при 37 °С.Учет результатов проводится через 48 ч инкубирования по индукции обратныхмутаций к гистидиновой прототрофности. Подсчитывали и сравнивается числоколоний (КОЕHis+ревертанты/чашка), выросших в присутствии исследуемыхсоединений и в негативном контроле (рисунок 2.3).Согласно рекомендациям по проведению теста Эймса, исследуемыесоединения расцениваются как мутагенные, если число колоний-ревертантов,выросших в их присутствии, достоверно превышает число колоний-ревертантов внегативном контроле более чем в 2 раза [377].АБВРисунок 2.3 – Колонии ревертантов Salmonella typhimurium TA 100 внегативном контроле (А), в опытном варианте (Б) и в позитивном контроле(азид натрия, 2,5 мкг/чашку) (В)В работе использовалась следующая система оценки соединений на наличиемутагенной активности [147]:- отсутствие мутагенной активности – КОЕ His+ревертантов/чашка,выросших в присутствии исследуемого соединения, и в негативном контроледостоверно различается менее чем в 2,5 раза;- слабая мутагенная активность – КОЕ His+ревертантов/чашка, выросших вприсутствии исследуемого соединения, от 2,5 до 10 раз превышает числоколоний-ревертантов в негативном контроле;124- средняя мутагенная активность – КОЕ His+ревертантов/чашка, выросших вприсутствии исследуемого соединения, от 10 до 100 раз превышает числоколоний-ревертантов в негативном контроле;- сильная мутагенная активность – КОЕ His+ревертантов/чашка, выросших вприсутствии исследуемого соединения превышает спонтанный фон мутирования(негативный контроль) более чем в 100 раз.2.8.
SOS-хромотестSOS-хромотест рекомендован для изучения механизма антибактериальногодействия, основанного на воздействие исследуемых соединений на ДНК. SOSсистема прокариот – это защитная система бактерий, которая активируется вответ на серьезные повреждения ДНК или ингибирование репликации и запускаетцепь защитных реакций, в том числе экспрессию многих генов, связанных срепарацией.
Физиологические изменения в клетке под действием SOS-системыназывают SOS-ответом [117].ВнастоящейработедляоценкиSOS-индуцирующейактивностисоединений использован SOS-хромотест, предложенный в 1982 г. PhilippeQuillardet с коллегами. В процессе исследования использовалась тест-система, вкоторой индукцию SOS-оперонов в присутствии различных концентрацийисследуемого вещества оценивают по абсолютному значению активности βгалактозидазы [407].В качестве тестерного штамма в исследовании использован штаммEscherichia coli PQ 37 с генотипом F- thr leu his-4 pyrD thi galE galК lacΔU169srl300::Th10 rpoB rpsL uvrA rfa trp::Mис+ sfi A::Mud(Aр, lac)cts.Благодаряприсутствию «сшивки» генов sfi A::lac Z, экспрессия гена β-галактозидазы lacZ вштамме PQ 37 находится под контролем промотора гена sfiA, одного изкомпонентов SOS-регулона E.coli.
Показателем SOS-индуцирующей активностиисследуемых соединений в SOS-хромотесте является активность β-галактозидазы,которая оценивается относительно активности конститутивного фермента125микроорганизмов – щелочной фосфатазы, что позволяет контролировать такжетоксический эффект исследуемых соединений на клетки бактерий [407].Этапы культивирования тест-штамма:- культура тест-штамма E.coli PQ37 со скошенного агара переноситсябактериологической петлей в пробирку, содержащую 5 мл LВ-бульона сампициллином (20 мкг/мл), и культивируется 12 ч при 37 °С;- 12-часовая «ночную» культура тест-штамма E.coli PQ37 разводится вотношении1/3свежимLВ-бульономсампициллином(20мкг/мл)иподращивается при 37 °С с аэрацией (это необходимо для достиженияэкспоненциальной фазы роста(оптическая плотность суспензиидолжнасоответствовать 0,4 ед. при 600 нм);- бактериальная суспензия разливается по 0,9 мл в пробирки, содержащие100 мкл раствора исследуемого соединения в разных концентрациях;- бактериальная суспензия разливается по 0,9 мл в пробирки, содержащиеДМСО («негативный контроль»);- бактериальная суспензия разливается по 0,9 мл в пробирки, содержащиераствора мутагена митомицин С (10 мкг/мл) (заведомо известный индуктор SOSответа клетки, «позитивный контроль»);- пробы инкубируются при 37 °С 24ч;-определяетсяактивностьферментовщелочнаяфосфатазаиβ-галактозидаза.2.8.1.
Определение щелочной фосфатазыАктивность щелочной фосфотазы определяет влияние исследуемогосоединения на выживаемость клеток.Этапы определения активности фермента щелочная фосфотаза:- бактериальная суспензия в объеме 300 мл смешивается с 2,7 мл Т-буфера;- измеряется оптическую плотность раствора при длине волны 600 нм(спектрофотометр Shimadzu UV-1800 (Japan);126- в пробирки (для разрушения клеток) добавляется 0,15 мл хлороформа и 0,1мл 0.1% SDS (додецилсульфат натрия);- полученная смесь инкубирутся на водяной бане 5 мин при 28 °С;- в пробирки с лизатами клеток добавляется 600 мкл раствор рнитрофенилфосфата (4 мг/мл в Т-буфере);- полученная смесь инкубируют 30 мин при комнатной температуре;- к смеси добавляется 1 мл 2М HCl (для остановки реакции);- через 5 мин добавляется 1 мл 2М Tris (для стабилизации окраски)- измеряется оптическая плотность каждой смеси при длинах волн 420 и 550нм (спектрофотометр Shimadzu UV-1800 (Japan).Активность фермента щелочная фосфатаза рассчитывается по формуле (2)[72].Агде, 1.75 – поправочный коэффициент;D420, D550, D600 – соответствующие значения оптической плотности дляреакционной смеси;t – время реакции (мин);V – объем культуры, взятой для определения (мл).2.8.2.
Определение активности β-галактозидазыЭтапы определения активности фермента β-галактозидаза:- бактериальная суспензия в объеме 300 мл смешивается с 2,7 мл Т-буфера;- измеряется оптическую плотность раствора при длине волны 600 нм(спектрофотометр Shimadzu UV-1800 (Japan);- в пробирки (для разрушения клеток) добавляется 0,15 мл хлороформа и 0,1мл 0,1% SDS (додецилсульфат натрия);127- полученная смесь инкубирутся на водяной бане 5 мин при 28 °С;- пробирки со смесями сильно встряхивают;-впробиркислизатамиклетокдобавляетсяо-нитрофенил-галактопиранозид (4 мг/мл в Z-буфере);- полученная смесь инкубируют 30 мин при комнатной температуре;- к смеси добавляется 2 мл 1М Na2CO3 (для остановки реакции);- измеряется оптическая плотность каждой смеси при длинах волн 420 и 550нм (спектрофотометр Shimadzu UV-1800 (Japan).Активность фермента β-галактозидаза рассчитывается по формуле (2) [72].Для количественной оценки SOS-ответа используют показатель IF (факториндукции SOS-ответа клетки), который определяется по формуле (3) [408]:где,Активностьалактозидазы в опытеАктивность елочной фофсфотазы в опытеАктивностьалактозидазы в контролеАктивность елочной фосфотазы в контролеФактор индукции SOS-ответа клетки IF > 2 свидетельствует о том, чтоисследуемоесоединениеобладаетспособностьюповреждатьДНКилиингибировать репликации [366].2.9.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
