Диссертация (1139676), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Агар Мюллера-Хинтона (М173) HiMedia LaboratoriesPvt.LimitedСоставг/лВытяжка говядины300,0Кислотный гидролизат казеина17,0Крахмал1,5Агар-агар17,0Дистиллированная вода1000,0 млКонечное значение рН (при 25 °С) 7,3±0,2Для приготовления кровяного агара асептично вносят стерильнуюдефибринированую кровь барана (до 5 % об.). Тщательно перемешать.Поддерживает рост многих микроорганизмов. Крахмал служит «защитнымколлоидом» против токсичных веществ, вырабатываемых в процессе роста.103Среда № 9. Бульон Мюллера-Хинтона (М391) HiMedia LaboratoriesPvt.LimitedСоставг/лВытяжка говядины300,0Кислотный гидролизат казеина17,0Крахмал1,5Дистиллированная вода1000,0 млКонечное значение рН (при 25 °С) 7,4±0,2Для приготовления кровяного бульона асептично вносят стерильнуюдефибринированую кровь барана (до 5% об.).
Тщательно перемешать.Поддерживает рост многих микроорганизмов. Крахмал служит «защитнымколлоидом» против токсичных веществ, вырабатываемых в процессе роста.Среда № 10. Желточно-солевой агарВ качестве основы используют элективный солевой агар для стафилококковили МПА с 10% раствором поваренной соли. По прописи готовят 1,8-2,0% агар,рН 7,2-7,4.
К расплавленному и охлажденному до 45 °С агару, соблюдая правилаасептики, добавляют 20 % желточной взвеси (1 желток на 200 мл стерильногоизотонического раствора хлорида натрия).Один из компонентов яичного желтка – лецитовителлин, который являетсясубстратом для фермента лецитовителлазы – лецитиназы, относящейся к группелипаз и продуцируемой некоторыми стафилококками. При расщеплениилецитовителлина вокруг лецитиназоположительных колоний на поверхностисреды образуется радужный венчик.
Добавление в среду молока стимулируетобразование стафилококками золотистого или лимонно-желтого пигмента,относящегося к группе каротиноидов.104Среда № 11. Висмут-сульфит-агар ЗАО «НИЦФ»Составг/лГовяжий экстракт5,0Пептон10,0Декстроза5,0Фосфат натрия (двузамещенный)4,0Сульфат железа0,3Индикатор сульфита висмута8,0Бриллиантовый зеленыйАгар-агарДистиллированная вода0,02520,01 000,0 млОсновной сульфит висмута и бриллиантовый зеленый подавляют ростграмположительных микроорганизмов и многих энтеробактерий, в том числе ишигелл. Бактерии, образующие сероводород, формируют на среде черные икоричнево-черные, иногда с темно-зеленым оттенком, часто с металлическимблеском, колонии.
Это происходит за счет того, что образуемый бактериями изсульфата железа сероводород вызывает почернение индикатора – бесцветногосульфита висмута вследствие перехода его в сульфид висмута – вещество черногоцвета. При этом среда под колониями тоже окрашивается в черный цвет.Бактерии, не образующие сероводород, растут в виде мелких, бесцветныхколоний.Среда № 12. Среда Плоскирева ЗАО «НИЦФ»СоставПанкреатический гидролизат килькиг/л16,0Натриевые соли желчных кислот8,1Лактоза12,9Фосфат натрия двузамещенный2,25Цитрат натрия8,82Тиосульфат натрия6,86105Йод металлический0,12Карбонат натрия1,42Нейтральный красный0,04Бриллиантовый зеленый0,02Агар-агар8,75Дистиллированная вода1 000,0 млМикроорганизмы, способные расщеплять лактозу (лактозопозитивные),образуют колонии темного красного цвета. Лактозонегативные микробы даютрост в виде бесцветных или слабо окрашенных колоний.
Соли желчных кислот,бриллиантовый зеленый и йод полностью подавляют рост грамположительныхбактерий, значительно задерживают (в первые 24 часа) развитие эшерихий идругих колиморфных бактерий, а также предотвращают роение протея. Свойствасреды не могут обеспечить рост S.dysenteriae и некоторых других сальмонелл.Среда № 13. Основа среды Левенштейна-Йенсена (М1542) без крахмалаHiMedia Laboratories Pvt.LimitedСоставг/600 млL-Аспарагин3,60Калия дигидрофосфат2,40Магния сульфат0,24Магния цитрат0,60Малахитовый зеленый0,40Дистиллированная вода600,0(содержащая 12 мл глицерина)Яичная эмульсияСреда1000,0Левенштейна-Йенсенасдобавлениемяичнойэмульсиииспользуется для выращивания микобактерий, выделения чистой культуры идляоценкичувствительностикпротивотуберкулезнымпрепаратам.Наилучшие условия роста достигаются при 35 °С в атмосфере 5-10 %углекислого газа.
M.tuberculosis через 2-4 недели при 35 °С в атмосфере 5-10106% углекислого газа дают обильный рост, колонии гранулированные,неровные, бородавчатые, сухие, рыхлые.2.1.7. Характеристика экспериментальных животныхВ качестве экспериментальных животных использовались нелинейныебелые мыши обоего пола (массой 18-22 г) и белые беспородные крысы обоегопола (массой 180-200 г).
Экспериментальных животных содержали на обычномрационе вивария в боксированных помещениях при температуре окружающейсреды 18-20°С. Проведение экспериментального исследования проводилось всоответствии со ст. 21 Конституции Российской Федерации, ХельсинкскойдекларациейВсемирноймедицинскойассоциации«Этическиепринципыпроведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектовисследования», принятой на 18-й Генеральной Ассамблее ВМА (Финляндия, 1964г., в пересмотре от 2013г.), Федеральным законом от 21 ноября 2011 г. N 323-ФЗ«Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации», Национальнымстандартом РФ ГОСТ Р 52379-2005 «Надлежащая клиническая практика (GoodClinical Practice (GCP))» (утв.
приказом Федерального агентства по техническомурегулированию и метрологии от 27 сентября 2005 г. N 232-ст), Федеральнымзаконом от 12 апреля 2010 г. № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств»,«Правилами надлежащей клинической практики» (утв. приказом МинздраваРоссии от 01.04.2016 г. № 200н), «Правилами лабораторной практики вРоссийской Федерации» (утв. приказом Минздравсоцразвития России от23.08.2010 г. № 708н.), Федеральным законом от 27 июля 2006 г.
№ 152-ФЗ «Оперсональных данных», Приказом Минздравсоцразвития России от 26 августа2010 г. N 748н «Об утверждении порядка выдачи разрешения на проведениеклиническогоисследованиялекарственногопрепаратадлямедицинскогоприменения», Рекомендациями ВАК РФ «О порядке проведения биомедицинскихисследований у человека (опубликованными в Бюллетене ВАК МинобразованияРФ(№3,2002г.))ииныминормативно-правовымидокументами,107регламентирующими проведение биомедицинских исследований с участиемчеловека и животных, а также действующим законодательством РоссийскойФедерациииРеспубликиМордовия.Протоколыэкспериментальныхисследований настоящей работы прошли биоэтическую экспертизу на заседанииЛЭК Медицинского института ФГБОУ ВПО «МГУ им.
Н.П. Огарева» (протокол№45, декабрь 2016 года).1082.2. Основные этапы проведения тестирования чувствительностимикроорганизмов к исследуемым соединениямВкачествеактивноститест-микроорганизмовисследуемыхсоединенийдляизученияиспользовалипротивомикробноймузейныештаммы:Stаphylоcоссиs аиrеиs 25923 АТСС, Stаphylоcоссиs аиrеиs АТСС 6538-Р,Stаphylоcоссиs аиrеиs 43300 АТСС (МRSА), Еsсhеriсhiа соli 25922 АТСС,Рsеиdоmопаs аеrиginоsа 27853 АТСС, Strерtососсиs руоgеnеs 1238 АТСС,Strерtососсиs руоgеnеs 19615 АТСС, Strерtососсиs рпеиmопiае 49619 АТСС,Sаlmопеllа епtеritidis 5765 АТСС, Shigеllа sоппеi S-form, Рsеиdоmопаs аеrиginоsа453, Еsсhеriсhiа соli М-17, Stаphylоcоссиs аиrеиs 906, Епtеrососсиs fаесаlis 19433АТСС, Сitrоbасtеr frеипdii 101/57, Рrоtеиs vиlgаris «Цвemкoв», Кlеbsiеllарпеиmопiае 13883 АТСС, Васillиs сеrеиs 96, Мусоbасtеriит tиbеrсиlоsis.Вкачествеопытныхисследовалисьштаммымикроорганизмовизолированных из материала, взятого от больных с неспецифическими испецифическими заболеваниями органов дыхания и мочевыводящих путей,кишечника с различной чувствительностью к традиционно применяемымантимикробным препаратам.
Источником выделения патогенов служила моча,мокрота, слизь из зева, носа и носоглотки, отделяемое ран, фекалии, секционныйматериал.Верификациюлабораторныхштаммовмикроорганизмовпроводилибактериологическими методами по классической методике [99]. Окончательнуюидентификациютрадиционнымиопределениеантимикробнымчувствительностипрепаратаммикроорганизмовпроводилискпомощьюавтоматической бактериальной системы «Sensititrе» (UK).Для изучения противомикробной активности исследуемые соединенияиспользовали в виде раствора.Для определения антимикробной активности исследуемых соединенийиспользовали два метода [80; 81]: метод серийных разведений в бульоне(макрометодом «пробирочным») и диско-диффузионный метод (ДДМ). Но, так109как в работе исследовались новые соединения, нам пришлось внести некоторыемодификации в традиционно применяемые, для известных препаратов, методы.Длякультивированиямикроорганизмов,храненияиоценкичувствительности использовали специально предназначенные для этих целейсреды, разрешенные к применению в Российской Федерации в установленномпорядке и по своим характеристикам удовлетворяющие требованиям [80; 81; 117].Внутрилабораторный контроль качества среды проводили при использованиивсех сред, разрешенных к применению в Российской Федерации в установленномпорядке.Метод серийных разведений в бульоне (макрометодом «пробирочным»).Бактериальную суспензию готовили из агаровых культур.
Для приготовленияинокулюмаиспользоваличистуюсуточнуюкультурумикроорганизмов,выросших на плотных питательных средах. Отбирали несколько однотипных,четкоизолированныхколоний,выросшихнанеселективныхплотныхпитательных средах. Петлей переносили незначительное количество материала сверхушек колоний в пробирку со стерильным физиологическим раствором,доводя плотность инокулюма точно до 0,5 по стандарту Мак-Фарланда, в работеиспользовали коммерческий стандарт мутности. Инокулюм использовали втечение 15 мин после приготовления.Для взвешивания субстанций использовали электронные лабораторныевесы с точностью до 4 знака, для измерения объемов – калиброванные дозаторы ипипетки.
Основные растворы исследуемых соединений готовили в концентрации1,0 мг/мл. Навески исследуемых соединений для приготовления базовыхрастворов готовили с учетом их активности. Основные растворы былииспользованы для приготовления рабочих растворов. Из рабочих растворовготовили двукратные разведения исследуемых соединений. При расчетах заоснову бралась конечная концентрация исследуемого соединения в питательнойсреде, равная 0,25 мг/мл и более низкие концентрации – 0,125; 0,062; 0,031 и т.д.Тестирование проводили в объеме 1 мл каждого разведения исследуемогосоединения с конечной концентрацией исследуемого микроорганизма примерно1105×105 КОЕ/мл.Мюллер-Хинтон бульон (МХБ) (для стрептококков с содержанием крови)для определения чувствительности разливали по 0,5 мл в каждую пробирку.Количество пробирок составило девять штук плюс одна для постановки«отрицательного»контроля,т.е.десять.Рабочийрастворисследуемогосоединения готовили из основного раствора с использованием жидкойпитательной среды - МХБ.
Затем рабочий раствор в количестве 0,5 мл припомощи микропипетки со стерильным наконечником вносили в первую пробирку,содержащую 0,5 мл бульона. Тщательно перемешивали и новым стерильнымнаконечником переносили 0,5 мл раствора исследуемого соединения в бульоне вовторую пробирку, содержавшую первоначально 0,5 мл бульона. Эту процедуруповторяли, пока не был приготовлен весь необходимый ряд разведений. Изпоследней пробирки 0,5 мл бульона удаляли (рисунок 2.1).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
