Диссертация (1139676), страница 21
Текст из файла (страница 21)
Определение типа противомикробного действия исследуемыхсоединенийДля определения типа противомикробного действия использовалиметодику проведения опытов при воздействии исследуемых соединений вфизиологическомраствореприкомнатнойтемпературеикороткихэкспозициях.
Для исследования готовили растворы исследуемых соединенийразличной концентрации в физиологическом растворе (из расчета, что в работеиспользовали нихромовую петлю объемом 0,8 мм3) и разливали по пробиркам(по 1 мл). Контрольные пробирки не содержали исследуемых соединений.Одновременно готовили взвесь бактерий в физиологическом растворе всоответствии со стандартом мутности 0,5 по Мак-Фарланду и добавляли по 1 млв пробирки с различными разведениями исследуемых соединений. Отмечаливремя, а затем через 5, 10, 15 и 30 мин, 1, 2 и 4 ч с помощью нихромовой петлиделали высевы в пробирки, содержащие 1 мл МХБ. Пробирки помещали втермостат при 37 °С и наблюдали в течение 5 сут. Для определения наличияроста микроорганизма пробирки с посевами просматривали в проходящемсвете. В контрольных пробирках быстро появляется рост.
Также быстро обычнопоявляется рост и при высевах из пробирок, содержащих не бактерицидныеконцентрации исследуемого соединения. Запоздалый рост тоже свидетельствует117об отсутствии бактерицидного действия. В этом случае, можно говорить толькоо задержке роста и размножения микроорганизмов и бактериостатическом типедействия соединения [87]. В ходе работы возникла необходимость вмодификации метода.
Дополнительно рост микроорганизмов фиксировали поизменениюоптическойфотоэлектроколориметрическиплотностискультуральнойиспользованиемФЭКApelжидкости«АР-101».Исследования проводили в объеме 1 мл в стерильных кюветах при длине волны600 нм. Зависимость оптической плотности исследуемого соединения скультурой микроорганизмов обнуляли по показателям оптической плотностиисследуемого вещества. Полученную оптическую плотность микроорганизмов,культивируемых в присутствии противомикробного соединения, сравнивали соптическойплотностьюмикроорганизмов,культивируемыхбезпротивомикробного соединения.2.6.
Определение цитотоксичности исследуемых соединений in vitroДля оценки цитотоксического действия исследуемых соединений наэукариотические клеткииспользовалсяскрининговыйметодопределениявыживаемости клеток – МТТ-тест [379]. Принцип данного метода базируется наспособности митохондриальных дегидрогеназ живой метаболически активнойклетки превращать водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил2Н-тетразолиум бромид (МТТ) в формазан, который выпадает в виде кристалловвнутри клетки.
Растворение формазана с помощью диметилсульфоксида (ДМСО)и последующая фотометрия цветного (фиолетового) раствора позволяет косвеннооценить долю погибших клеток под влиянием изучаемого соединения поизменению оптической плотности раствора в опытных лунках по отношению кконтрольным [367; 212].Линия опухолевых клеток HeLa (ATCC® CCL-2TM), используемая в работе,получена из коллекции банка глубокозамороженных клеточных культур ГУ«НИИВ им. Д.
И. Ивановского РАМН» и представляет собой эпителиальные118клетки аденокарциномы шейки матки человека, прилипающие к подложке(рисунок 2.2).Рисунок 2.2 – Эпителиальные клетки аденокарциномы шейки маткичеловека (HeLa ATCC ® CCL-2TM)Культивирование опухолевых клеток осуществляется в среде RPMI-1640(разработана Roswell Park Memorial Institute; изготовитель НПП «ПанЭко»,Россия) в пластиковых флаконах (Corning, США) при 37 °С, 100% влажности и5% содержании углекислого газа в окружающем воздухе.
Пересев клеточнойкультуры производится каждые 3 дня. Во время пассажа клетки снимаются споверхности пластикового флакона смесью ЭДТА в физиологическом (растворВерсена; НПП «ПанЭко», Россия) и 0,25% раствора трипсина (ПанЭко, Россия) (всоотношении 1:1) в течение 3-5 мин при 37 °С. После «ошпаривания» клеток иоткрепления их от дна флакона, трипсин инактивируется добавлениемпитательной культуральной среды с 10% эмбриональной телячьей сывороткой(НПП «ПанЭко», Россия) [6].Дляопределенияспособностиисследуемыхсоединенийоказыватьцитотоксическое действие рассев клеточной культуры осуществляется в лунки 96луночногоплоскодонногопланшета,концентрация1-2×104клеток/лунка.Культивирование требует 37 °С, 100% влажности и 5% содержания углекислого119газа в окружающем воздухе.
Исследуемые соединения в концентрациях 50мкг/мл, 500 мкг/мл, 1000 мкг/мл вносят после формирования монослоя и заменыкультуральнойсреды.Длительностьинкубированиясисследуемымисоединениями составляет 48 ч. За 4 ч до окончания инкубирования в каждуюлунку вносится 20 мкл раствора МТТ (5 мг/мл) (НПП «ПанЭко», Россия) иинкубирование продолжается оставшиеся 4 ч. По окончании инкубирования средаудаляется и в каждую лунку добавляется по 200 мкл ДМСО.
Осадокресуспензируется и растворяется в течение 15 мин в темноте при комнатнойтемпературе. Оптическая плотность раствора определяется на микропланшетномИФА-фотометре (Immunochem 2100 «High Technology Inc.», США) при длиневолны 492 нм. Долю жизнеспособных клеток рассчитывают в процентах поотношению к контролю.
Исследуемое соединение оказывает цитотоксическоедействие, если его процентный показатель оптической плотности меньше 70 %.Если показатель оптической плотности превышает 70 %, то данное соединение неоказывает цитотоксического действия на культуру клеток [1; 34].2.7. Изучение генотоксичности исследуемых соединений in vitroТест Эймса Salmonella/микросомы получил широкое распространение припервичном выявлении генетической активности агентов различной природы [68].Это тест-система, была разработана в 60-е годы XX века Брюсом Эймсом.Американский исследователь длительное время изучал природу мутационныхизменений в генах мутантов Salmonella typhimuium [186]. В тесте Эймсаиспользуются ауксотрофные по гистидину штаммы Salmonella typhimuium,которые под действием мутагенов способны ревертировать к прототрофности.Некоторые мутантные штаммы содержат мутации типа замены пар оснований (hisG46), а другие – мутации типа сдвига рамки считывания (his 3052).
Со временемвозникла необходимость в совершенствовании теста Эймса, поэтому наряду схорошо изученными мутациями потребности в гистидине, в геном сальмонеллывведена делеция по одному из генов репарации (uvrB-bio), что повышает120чувствительность бактерий к мутагенам.
Также в геном тестерных штаммоввведена rfa-мутация, блокирующая синтез липополисахаридной капсулы, дляповышения проницаемости клеток. Некоторые тестерные штаммы Salmonellatyphimurium содержат плазмиду pKM 101, содержащую гены, повышающуючувствительность клеток к агентам, усиливающим рекомбинацию ДНК ииндуцирующим SOS-мутагенез. Также, благодаря данной плазмиде, клетки тестштаммов резистентны к ампициллину, что используется как маркер присутствияплазмиды [355; 377]. Тест Эймса впервые позволил изучить мутагенныйпотенциал огромного числа химических соединений – это пепел сигарет, пищевыеконсерванты, средства для окрашивания волос, образцов природных комплексов(вода, почва) и т.д. [40; 377].Принцип теста Эймса базируется на культивировании тест-штаммовSalmonella typhimurium ауксотрофных по гистидину, т.е.
нуждающиеся в нем, наспециальной питательной среде не содержащей гистидин. Видимый рост наиспользуемой среде могут давать штаммы в которых произошли мутационныеизменения от ауксотрофности по гистидину к прототрофности. Мутационныереверсии такого рода без внешних воздействий наблюдаются с низкой частотой.Если засеять безгистидиновую среду ауксотрофным штаммом Salmonellatyphimurium и добавить химический мутаген, то по числу колоний, выросших наданной селективной среде, определяется частота мутаций, которая значительноувеличивается. Следует отметить, что теста Эймса имеет определенныеограничения, так как тестирование образцов, содержащих свободный гистидин,является невозможным.2.7.1. Тест на токсичность по отношению к Salmonella typhimuriumДанный тест проводится с целью подбора оптимальных (нетоксичных длятестерного микроорганизма) концентраций исследуемого соединения для ихдальнейшего использования в тесте по оценке мутагенной активности (тест121Эймса).
В исследовании на токсичность в качестве тест-штамма был использованSalmonella typhimurium ТА100.Чистая культура тест-штамма Salmonella typhimurium ТА100 со скошенногоагара (LB-среда агаризованная) переносится в 5 мл LВ-бульона и культивируетсяпри температуре 37 °С 12 ч.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
