Диссертация (1139676), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Таким образом,получали ряд пробирок с растворами исследуемого соединения, концентрациикоторых отличались в соседних пробирках в 2 раза. Затем засевали культуройисследуемого микроорганизма и после инкубации оценивают наличие илиотсутствие видимого роста. Конечная концентрация микроорганизм в каждойпробирке составляла примерно 5×105 КОЕ/мл.
Все пробирки, кроме пробирки«отрицательный» контроль, инкубировали в обычной атмосфере при температуре37 °С в течение 16-20 или 20-24 ч (в зависимости от вида тестируемогомикроорганизма). Пробирку «отрицательный» контроль помещали в холодильникпри 4 °С, где хранили до учета результатов. Для определения наличия ростамикроорганизма пробирки с посевами просматривали в проходящем свете. Росткультуры в присутствии исследуемого соединения сравнивали с референтнойпробиркой («отрицательный» контроль), содержащей исходный инокулюм ихранившейся в холодильнике.
МПК определяли по наименьшей концентрацииисследуемого соединения, которая подавляет видимый рост микроорганизма.В ДДМ в качестве носителя исследуемого вещества использовалибумажныедиски(стандартизированныедискиНД-ПМП-1изкартонатехнического фильтровального ГОСТ 6722-75 (ФГУН «Санкт-Петербургский111научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Л.Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей иблагополучияпропитывалимикродозатора.человека).НепосредственноисследуемымВкачествесоединениемконтроляпередиприменениемдиоксидиномиспользовалидиски,сдискипомощьюпропитанныедистиллированной водой.Диско-диффузионный метод. Для определения чувствительности ДДМиспользовали стандартный инокулюм, соответствующий по плотности 0,5 постандарту Мак-Фарланда и содержащий примерно 1,5×108 КОЕ/мл.Для инокуляции приготовленных чашек с агаром использовали стерильныеватные тампоны промышленного производства (палочка-тампон (пластик-хлопок)CITOSWAB стерильный в индивидуальной упаковке).
Тампон погружали встандартную суспензию микроорганизма, затем избыток инокулюма удаляли,отжав тампон о стенки пробирки. Инокуляцию проводили штриховымидвижениями в трех направлениях, поворачивая чашку Петри на 60°. Зоныподавления роста, исследуемого штамма микроорганизма, образовавшиеся врезультате диффузии исследуемого вещества из носителя в Мюллер-Хинтон агар(МХА),определялиспомощьюлинейки-лекало(HiMediaLaboratoriesPvt.Limited). Степень активности к исследуемым соединениям определялась вкрестах по следующей схеме [80]: «+++» высокая активность - диаметр зонызадержки роста более 25 мм; «++» активное - диаметр зоны задержки роста 16-25мм; «+» малоактивное - диаметр зоны задержки роста 10-15 мм; «+/-, 0» неактивное - диаметр зоны задержки роста менее 10 мм и полное отсутствие.Содержание препаратов в диске соответствовало МПК×2 соединения.112Контроль1.
МХБ (мл): 0,50,50,50,50,50,50,50,50,50,52. В 1 мл ДМСО внести 5 мг исследуемого вещества. Добавить 4 мл МХБ (в 5 мл – 5 мг вещества), 0,5 мл полученногорабочего раствора исследуемого соединения добавить в первую пробирку (мл):0,50,50,50,50,50,50,50,50,5вдез.растворРабочий раствор исследуемого соединения (мл/мкг)(250 мкг)(125 мкг) (62,5 мкг) (31,3 мкг) (15,7 мкг) 7,9 мкг) 3,9 мкг)(1,96 мкг) (0,98 мкг)3. В 1 мл физиологического раствора внести микроорганизмы в соответствии со стандартом мутности 0,5 по МакФарланду.
0,1 мл приготовленного раствора с микроорганизмами внести в 10 мл МХБ. 0,5 мл МХБ с микроорганизмамивнести в каждую пробирку.0,50,50,50,50,50,50,50,50,50,5Инокулюм исследуемого микроорганизма (мл)Рисунок. 2.1 – Схема определения МПК исследуемых соединений1132.3. Определение чувствительности микобактерий к исследуемымсоединениямВ соответствии с законодательством РФ [120; 143; 97] к работе сматериалом, зараженным туберкулезными и нетуберкулезными микобактериями(III-IV группы), допускаются лаборатории, имеющие специальное разрешениеЦентраГосударственногонормированияМинздравасанитарно-эпидемиологическогоРФ.Поэтомувсеработыпонадзораиисследованиючувствительности микобактерий к исследуемым соединениям проводились вГКУЗ РМ «Республиканский противотуберкулезный диспансер», г.
Саранск.В нашей стране получило распространение определение лекарственнойустойчивости методом абсолютных концентраций на среде ЛевенштейнаЙенсена.В питательную среду Левенштейна-Йенсена, не содержащую крахмал(крахмаладсорбируетлекарственныепрепараты),непосредственнопередсвертыванием добавляли рабочие разведения исследуемые соединения.Для исследования использовали штамм многократно проверенной культурыMycobacteriumtuberculosis,чувствительныйковсемиспытуемымпротивотуберкулезным препаратам.Выросшую на плотной питательной среде культуру (обязательно несколькоколоний) снимали платиновой лопаточкой и помещали в стерильную фарфоровуюступку или толстостенную стеклянную пробирку.
Тщательно растирали пестикомили стеклянной палочкой, постепенно добавляли по каплям стерильныйфизиологический раствор. Полученную суспензию отсасывали пастеровскойпипеткой и переносили в стерильную пробирку, диаметр которой соответствовалдиаметру пробирки с оптическим стандартом мутности. Суспензию культурыстандартизировали по оптическому стандарту Мак-Фарланда по плотности 0,5.Затем разводили в 10 раз стерильным физиологическим раствором. Дляэтого заранее приготовленный ряд пробирок по числу исследуемых культурмикобактерий и подписывали на них номера исследуемых культур. В каждую114пробирку наливали по 9 мл стерильного физиологического раствора. Послеприготовления суспензий всех взятых в опыт культур микобактерий в каждую изприготовленных пробирок вносили стерильной пипеткой по 1 мл приготовленнойпо стандарту 0,5 суспензии микобактерий.
Посев на среды с исследуемымисоединениями производили из этих суспензий (суспензия, приготовленная постандарту 0,5 и разведенная в 10 раз).Результат исследования учитывали на 21 день после посева. При скудномросте в контрольной пробирке все пробирки с препаратами оставляли еще на 1-2недели в термостате до получения выраженного роста в контроле, после чегодавали окончательный ответ.
Культуру считали чувствительной к даннойконцентрации соединения, если в пробирке со средой, содержащей препарат,выросло менее 20 колоний при обильном росте в контрольной пробирке.Культуру считали устойчивой к той концентрации соединений, котораясодержала в данной пробирке, если в пробирке со средой выросло более 20колоний.2.4. Изучение острой токсичности исследуемых соединенийВ работе изучали действие исследуемых соединений, проявляющееся послеих однократного применения [117]. Основные параметры острой токсичностиизучаемых соединений среднелетальные дозы LD50, LD16, LD84 вычислялись спомощью метода Литчфилда и Уилкоксона.Исследуемыесоединенияиспользоваливвидерастворов,длявнутрибрюшинного введения и накожного нанесения в качестве растворителяиспользовали ДМСО и раствор хлорида натрия 0,9% (изотонический).
Дляпероральноговведенияиспользовалирастворхлориданатрия0,9%(изотонический). В эксперименте участвовали белые беспородные мыши (массой18-20 г) и белые беспородные крысы (массой 180-200 г) обоего пола. Дляопределения клинически здоровых животных, мышей и крыс распределяли115случайным образом на контрольные и опытные группы после предварительного5-ти дневного карантина и осмотра.Исследуемые соединения вводили однократно в максимально возможныхобъемах.
Перорально исследуемые соединения вводили мышам и крысам черезжелудочный зонд (в дозах от 100 до 2000 мкг/мл). Внутрибрюшинно исследуемыесоединения вводили мышам и крысам с помощью одноразовых шприцев (в дозахот 100 до 2000 мкг/мл) однократно.Предварительно на ночь лишив животных корма, оставляя при этом доступк питьевой воде. По истечению периода голодания животных взвешивали ивводили тестируемые соединения. После введения соединения животных такжелишали корма на 3-4 часа.Для изучения накожной токсичности соединения наносили на участок кожикрыс размером 5х5 см (в дозах от 2000 до 5000 мкг/кг).
За сутки до нанесенияизучаемого соединения у животных выстригали в области спины и боковшерстный покров размером 5х5 см. Соединение наносили однократно,равномерно распределив их по всей поверхности участка и слегка втирая в кожу.В качестве контроля использовали ДМСО и раствор хлорида натрия 0,9%(изотонический) (в аналогичных дозах).В эксперименте использовались животные одного возраста (2,5 мес.),которые распределялись по группам так, чтобы их индивидуальная масса неотличалась более, чем на 10 % от средней массы животных одного пола.
Закаждым животным наблюдение проводили отдельно, в течение первых 24 часовнепрерывно. Особенное внимание уделялось первым 8 часам после введениясоединения. Начиная со второго дня, на протяжении 14 суток, продолжали вестинаблюдение за животными в утренние и вечерние часы с учетом картиныинтоксикации. Наблюдение общего здоровья, выявление признаков токсичности,тяжелого состояния, смертности проводилось во всех группах в течении всегопериода наблюдения два раза в день. Осмотр осуществлялся в клетках, на руках,на открытой поверхности.
Суточное потребление корма и воды фиксировали довведения соединений, а также после введения ежедневно, визуально. Массу тела116животных определяли перед введением препаратов. А затем ежедневно в течениевсего периода наблюдения. Животных, павших в ходе эксперимента, вскрывали.По окончании эксперимента проводили эвтаназию и патологоанатомическоевскрытие всех выживших животных.Оценку общего состояния животных послевведения исследуемыхсоединений проводили с учетом изменения поведенческих реакций (двигательнаяактивность, груминг, акт приема корма, воды, акт дефекации). Наравне с этим,для оценки общего состояния, учитывали нервно-мышечную возбудимость,некоторые вегетативные функции.2.5.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
