Диссертация (1139676), страница 23
Текст из файла (страница 23)
Модель экспериментальной хирургической раневой инфекции in vivoЭкспериментальныеивотные. В качестве экспериментальных животныхиспользовались нелинейные белые мыши обоего пола (массой 18-22 г).128Экспериментальных животных содержали на обычном рационе вивария вбоксированных помещениях при температуре окружающей среды 18-20 °С.Исследуемые микроор анизмы.
Бактериальную суспензию S.aureus АТСС43300 и P.aeruginosa АТСС 27853 готовили из агаровых культур. Дляприготовленияинокулюмаиспользоваличистуюсуточнуюкультурумикроорганизмов, выросших на плотных питательных средах. Отбиралинесколькооднотипных,четкоизолированныхколоний,выросшихнанеселективных плотных питательных средах.
Петлей переносили незначительноеколичество материала с верхушек колоний в пробирку со стерильнымфизиологическим раствором, доводя плотность инокулюма точно до 0,5 постандарту Мак-Фарланда (в работе использовали коммерческий стандартмутности). Инокулюм использовали в течение 15 мин после приготовления.Экспериментальная рана и инфицирование.
За один день до заражениямышей анестезировали внутрибрюшинно инъекцией пентобарбитала натрия (30мг/кг). Спины мышей тщательно выбривали электрическим триммером с мелкимзубцом. В день заражения поверхностные хирургические раны были сделаны наспинах реанестезированных животных посредством продольного срединногоразреза 2,3±0,2 см в длину и простирающийся до panniculus carnosus. Кожа собеих сторон разреза была разведена, и раны были заражены прямым посевом.После инокуляции микроорганизма раны были временно закрыты небольшимипластырными полосками (Steri-strip, Е4541, США), чтобы гарантировать, чтораны остаются закрытыми в течение первых 24 часов после инфицирования. Ранав конечном итоге покрывала ≈ 6 % общей поверхности тела мыши [243; 187].Терапия инфицированных ран. Исследуемые соединения, растворенные вглицерине, и препараты сравнения наносили через 24 ч после инфицированиядважды в день (9.00 и 20.00).
После применения вещества осторожнораспределяли по поверхности раны пальцем в перчатках.Количественноеопределениемикроор анизмов.Количественноеопределение микроорганизмов в ранах проводилось методом поверхностныхсмывов. В первые, 2-е, 3-е, 4-е, 7-е сутки после инфицирования мышей129подвергали эвтаназии и с помощью стерильных пробирок, содержащих 5 млстерильной дистиллированной воды, плотно закрывали рану, таким образом,чтобы 90 % ее поверхности было закрыто краями пробирки.
Мышь и пробирку вперевернутом виде, удерживаемые в вертикальном положении, встряхивали 25раз,чтобыудалитьимеющиесямикроорганизмысповерхностираны.Полученную суспензию разбавляли соответствующим образом, а затем высевалина селективные среды, во избежание роста иных микроорганизмов, желточносолевой агар (молочно-солевой) для S.aureus, агар Эндо (агар Клиглера) дляP.aeruginosa. Высевы инкубировались в течение 24-48 часов при 37 °С после чегопроводился подсчет колоний (КОЕ/рана).Количествомикроорганизмовопределялипутемгомогенизацииинфицированных ран.
В первые, 2-е, 3-е, 4-е, 7-е сутки после инфицирования,раны и прилежащие ткани размером 2×2 см вокруг вырезали, и лоскут кожипомещали в питательный бульон и гомогенизировали в течение 3 минут вмногофункциональной центрифуге в пробирках для гомогенизации (Хеликон,Москва), для экстрагирования бактерий из зараженной кожи. Супернатантразбавлялся и объемом 0,02 мл с помощью микропипетки инокулировали навышеуказанные питательные среды. Высевы инкубировались в течение 24-48часов при 37 °С после чего проводился подсчет колоний (КОЕ/г).Одной из проблем, с которыми иногда сталкивается модельная инфекция,загрязнение.
Как и следовало ожидать, открытые раны иногда загрязнялисьграмотрицательными и грамположительными организмами с кожи, шерсти ифекалий. Чтобы исключить потенциальные проблемы при подсчете колоний,которые могли быть вызваны загрязняющими микроорганизмами, использовалиселективные среды.Инфицированные раны часто приводят к генерализации инфекции. С цельюоценки системной инфекции животных подвергали эвтаназии. Внутренниеорганы, такие как печень, селезенку, почки асептически удаляли, промывали вфизиологическом растворе, измельчали и инкубировали в питательном бульоне втечение 24-48 часов при 37 °С, а затем рассевали на селективные среды. Высевы130инкубировались в течение 24-48 часов при 37 °С после чего проводилсяопределение наличия тестируемых микроорганизмов.
Кровь забирали путемсердечной пункции и высевали непосредственно после забора в питательныйбульон, а затем рассевали на селективные среды.Высевы инкубировались втечение 24-48 часов при 37 °С после чего проводился определение наличиятестируемых микроорганизмов.Для инактивации остаточного количества исследуемых соединений ипрепарата сравнения, питательный бульон разбавляли до такой степени, чтобыконцентрации изучаемых противомикробных агентов не ингибировали ростиспытуемых микроорганизмов.Послекаждоговысевапроводилиопределениечувствительностиполученных микроорганизмов к исследуемым соединениям методом серийныхразведений.Все культуры S.aureus и P.aeruginosa, выделенные из крови и органовмышей, были исследованы с помощью бактериологического анализатора, чтобыгарантировать, что выделенные организмы имеют те же свойства, что ииспользуемый для инфицирования штамм.3.0. Статистическая обработка полученных результатовСтатистическую обработку полученных результатов проводили методамивариационной статистики, достоверность результатов оценивали с помощьюметода определения t-критерия Стъюдента [117; 42].
Данные обрабатывалистатистически на Intel Atom N570, применяя программу Stat 6.0. В работеиспользовали персональный компьютер и стандартный набор программ постатистике.131ГЛАВА 3. СИНТЕЗ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ СОЕДИНЕНИЙНА ОСНОВЕ ЗАМЕЩЕННЫХ 4-АМИНОИНДОЛОВ3.1. Синтез замещенных индолов, нитроиндолов, аминоиндоловИсходные аминоиндолы получали восстановлением гидразингидратом наактивной Ni-Ренея соответствующих нитроиндолов (схема 3.1) [3; 185].Схема 3.1R2R2R1O2NR1H2NNNR3R3RR3 = H, Me, OMeR= H, Me; R1= Me,Ph;RR2 2 = H,Me;RR35-,6-Нитроиндолы синтезировали прямым введением нитрогруппы вусловиях электрофильного замещения в бензольное кольцо соответствующихиндолов (схема 3.2) [3; 185].Схема 3.2R1R1R KNO3+H2 SO4(k.) O2NR2NHR21R= Me, Ph; R11 = H, Me; R2 =Me, OMe.RNH132Индолы получали индолизацией по Фишеру фенилгидразина и егопроизводных (схема 3.3).Схема 3.3R3R+Me-CO-R1R2RNH-NH2NHR = Me, OMe; R1 = Et, Ph; R2 = Me, Ph; R3 = H, Me.Аналогично из орто-нитрофенилгидразина и метилэтилкетона, минуястадию получения 2,3-диметилиндола, синтезировали 2,3-диметил-7-нитроиндол(схема 3.4).Схема 3.4MeMe+ Me-CO-EtNHNH-NH2NO2NO2Способы синтеза 4-нитроиндолов, основанные на прямом введении в ядроиндола нитрогруппы в условиях электрофильной реакции, для достиженияпоставленной цели оказались не пригодными.
Поэтому в работе использовалиреакции нуклеофильной замены водорода (SNH) в арильных системах. Способоснован на введении остатков различных нуклеофильных групп с дальнейшейгетероциклизациейвзаданным заместителем.конденсированноегетероциклическоесоединениес133Данныйметодбылиспользованнамидляполучения4-нитро-2-фенилиндола реакцией взаимодействия м-нитроанилина с ацетофеноном вприсутствии трет-бутилата калия (сильное основание) (схема 3.5).Схема 3.5NO2NO2Ph+ Me-CO-PhNHNH2Метилирование полученных нитроиндолов диметилсульфатом в щелочнойсреде с хорошим выходом приводило к соответствующим 1-метилнитроиндолам(схема 3.6).Схема 3.6R2R2R1 (Me)2SO4+KOHO2NRNHR1O2NRNMeR=H, Me, OMe; R1=Me, Ph; R2=H,Me.Синтезированные в работе аминоиндолы (рисунок 3.1) исследовались вреакциях с β-дикарбонильными соединениями.При этом в зависимости от структуры аминов и условий проведенияреакций были получены определенные соединения: циклические и нециклическиеамиды, замещенные пирролохинолоны.
Структура, биологическая активностьисследуемых веществ рассматривалась по признаку подобия в строении исходныхаминоиндолов.134NH2MeH2NPhMeNH12MeH2NN3H2NH2NNH2NMeNMeN11H2NMeNH12MeMeMeH2NPhNMeMeO9 MeMe MeH2NMeNH2NPh10Me8 MeMe7H2NNHMeMeOMe6MeH2NNMePhMe5 MePhMePhNH4MeNHMeMeMeH2NMeMeNNHNMeNH213NH214Me15Рисунок 3.1 – Синтезированные исходные аминоиндолы3.2.
Синтез и биологическая активность соединений на основе 4-амино2-фенилиндолаВ ходе настоящей работы были исследованы реакции 4-амино-2фенилиндола (1) с β-кетоэфирами (этиловым эфиром ацетоуксусной кислоты,этиловым эфиром трифторацето-уксусной кислоты). При этом были полученыновыесоединениянециклическийамиддигидропирролохинолон 18 (схема 3.7) [3; 185].16,пирролохинолон17,135Схема 3.7O(CF3)MeOONHNH2NHO MeOPhNHPh MeCF3COOHOMeNH16O1Ph17NHNHCF3HOPh18НаследующемэтапебылNHрассчитанпрогнозпотенциальнойфармакологической активности и токсичности (таблица 3.1). Для прогнозаналичия (Pa) или отсутствия (Pi) активности использовалась компьютернаясистема прогнозирования биологической активности веществ PASS (Prediction ofActivity Spectra for Substances) на основе анализа так называемых обучающихвыборок, содержащих десятки тысяч молекул органических веществ различныххимических классов, проявляющих множество видов биологической активности[145; 495; 146].
В своей работе мы использовали версию 9.1, зарегистрированнуюв 2007 году.Для дальнейшего экспериментального изучения отбирались вещества свероятностью наличия противомикробной активности в фармакологическомспектре более 50%, т.е. Ра более 0,500 вне зависимости от вероятности ипрогнозной степени токсичности.136Таблица 3.1 – Внеэкспериментальный прогноз противомикробнойактивности в ряду производных замещенного 4-амино-2-фенилиндолаСоединениеСтруктурная формулаPaO3-Оксо-N-(2-фенил-1Ниндол-4-ил)бутанамид (16-NHMePhO6D)6D0,572NHO4-Гидрокси-8-фенил-4(трифторметил)-1,3,4,7тетрагидро-2Н-пирроло[2,3-NHCF3HOPhh]-хинолин-2-он (18-5D)5D0,832NHO4-Метил-8-фенил-1,7дигидро-2Н-пирроло[2,3h]хинолин-2-он (17-17)NH0,611MePh17NHПроведено исследование противомикробной активности новых соединений3-оксо-N-(2-фенил-1Н-индол-4-ил)бутанамида (16, лабораторный шифр 6D), 4гидрокси-8-фенил-4-(трифторметил)-1,3,4,7-тетрагидро-2Н-пирроло[2,3-h]хинолин-2-она (18, лабораторный шифр 5D) и 4-метил-8-фенил-1,7-дигидро-2Нпирроло[2,3-h]хинолин-2-она (17, лабораторный шифр 17) [465].Относительно тест-штаммов микроорганизмов при исследовании методомсерийных разведений в МХБ соединение с лабораторным шифром 17 проявилоследующую активность: для S.aureus 25923 АТСС, E.coli 25922 АТСС,137P.aeruginosa 27853 АТСС, S.pyogenes 1238 АТСС, B.cereus 96 МПК исследуемогосоединения составили более 250 мкг/мл (таблица 3.2).Таблица 3.2 – Чувствительность тест-штаммов микроорганизмов ксоединению 17 (метод серийных разведений в Мюллер-Хинтон бульоне)S.aureusE.coli2592325922АТССАТСС250,0++++++++++125,0++++++++++62,5+++++++++++++31,3+++++++++++++++15,7+++++++++++++++7,9+++++++++++++++3,9+++++++++++++++1,96+++++++++++++++0,98+++++++++++++++питательной среде, мкг/млКонцентрация веществ вТест-культураP.aeruginosa27853 АТССS.pyogenes B.cereus123896АТСС«Отрицательный»+/+/+/+/+/контрольПримечание: «+++» – диффузное помутнение МХБ; «++» – умеренноепомутнение МХБ; «+» – слабое помутнение МХБ; «+/-» – отсутствие помутненияМХБ (как в «отрицательном контроле»); «0» – отсутствие роста при пересеве наМХА.При нагрузке 500 мкг/диск в ДДМ исследуемое соединение 17 значимойзадержки роста не вызывало в отношении исследуемых тест-штаммов, какграмположительных (S.aureus 906, S.aureus 43300 АТСС, S.pyogenes 19615 АТСС,S.pneumoniae 49619 ATCC, E.faecalis 19433 ATCC), так и грамотрицательныхмикроорганизмов (E.coli M-17, S.enteritidis 5765 ATCC, S.sonnei S-форма,138C.freundii 101/57, K.pneumoniae 13883, P.vulgaris «Цветков», P.aeruginosa 453)(таблица 3.3).Таблица 3.3 – Антибактериальная активность соединения 17 относительнотест-штаммов микроорганизмов (диско-диффузионный метод)Тест-штамм микроорганизмаЗона задержкироста (мм)Staphylococcus aureus 90614Staphylococcus aureus 43300 АТСС13Streptococcus pyogenes 19615 АТСС14Streptococcus pneumoniae 4961914ATCCEnterococcus faecalis 19433 ATCC12Escherichia coli M-1713Salmonella enteritidis 5765 ATCC11Shigella sonnei S-форма11Citrobacter freundii 101/5712Klebsiella pneumoniae 13883 АТСС11Proteus vulgaris «Цветков»11Pseudomonas aeruginosa 45313Примечание: соединение высокоактивно – полноеАктивностьсоединения 17малоактивномалоактивномалоактивномалоактивномалоактивномалоактивномалоактивномалоактивномалоактивномалоактивномалоактивномалоактивноотсутствие роста вдиаметре >25 мм; соединение активно – полное отсутствие роста в диаметре 16-25мм; соединение малоактивно – полное отсутствие роста в диаметре 10-15 мм;соединение неактивно – задержка роста не наблюдается.Это свидетельствует о том, что соединение с лабораторным шифром 17малоактивновотношенииисследованныхграмположительныхиграмотрицательных тест-штаммов микроорганизмов in vitro.По отношению к тест-штаммам микроорганизмов амид с лабораторнымшифром 6D проявил следующую активность: для S.aureus 25922 АТСС, E.coli25922 АТСС, P.aeruginosa 27853 АТСС, S.pyogenes 1238 АТСС, B.cereus 96 МПКисследуемого соединения составили более 250 мкг/мл (таблица 3.4).139Таблица 3.4 – Чувствительность тест-штаммов микроорганизмов ксоединению 6D (метод серийных разведений в Мюллер-Хинтон бульоне)S.aureusE.coli2592325922АТССАТСС250,0++++++++++125,0+++++++++++++62,5+++++++++++++++31,3+++++++++++++++15,7+++++++++++++++7,9+++++++++++++++3,9+++++++++++++++1,96+++++++++++++++0,98+++++++++++++++питательной среде, мкг/млКонцентрация веществ вТест-культураP.aeruginosa27853 АТССS.pyogenes B.cereus123896АТСС«Отрицательный»+/+/+/+/+/контрольПримечание: «+++» – диффузное помутнение МХБ; «++» – умеренноепомутнение МХБ; «+» – слабое помутнение МХБ; «+/-» – отсутствие помутненияМХБ (как в «отрицательном контроле»); «0» – отсутствие роста при пересеве наМХА.При нагрузке 500 мкг/диск в ДДМ исследуемое соединение 6D значимойзадержки роста не вызывало, как в отношении грамположительных (S.aureus 906,S.aureus 43300 АТСС, S.pyogenes 19615 АТСС, S.pneumoniae 49619 ATCC,E.faecalis 19433 ATCC), так и грамотрицательных исследуемых тест-штаммовмикроорганизмов (E.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
