Диссертация (1139568), страница 15
Текст из файла (страница 15)
За единицу активности каталазыпринимали то количество фермента, которого достаточно для разложения 50%пробы перекиси водорода. Спектрофотомерия выполнена на приборе «Genesys 5»(США).Для решения задачи по определению микроэлементного статуса пациентовс ГА была проведена оценка содержания 11 микроэлементов (цинка, железа,меди, кобальта, хрома, марганца, никеля, стронция, кадмия, висмута и свинца) вволосах и цельной крови методом атомно-адсорбционной спектрофотометрии.Исследование проведено в соответствии с методическими указаниям МУК4.1.776-99 и МУК 4.1.777-99 в санитарно-химической лаборатории ФГБОУ ВООрГМУ МЗ РФ (Заведующая – Н.П.
Хмельницкая; лицензия № Ф-56-01-000-803).Из 105 включенных в исследование пациентов оценка микроэлементного статусабыла выполнена у 100 больных ГА (исключение составили пациенты с тотальнойи универсальной алопецией).Использованиедвухбиосубстратовобъяснялосьнеобходимостьюкомплексного подхода к оценке микроэлементного статуса и оценке причинноследственной связи при изменении концентраций микроэлементов в условияхпатологического процесса.
Выбор в качестве биосубстрата цельной кровиобусловлен возможностью анализировать состояние обмена микроэлементов вмомент исследования и своевременной оценки экзо- и эндогенных воздействий наобмен микроэлементов и организм в целом. По сравнению с сывороткой илиплазмой крови, цельная кровь, содержащая клеточные элементы, несет болееполную информацию о содержании микроэлементов в организме. В эритроцитах75по сравнению с сывороткой или плазмой крови уровни микроэлементовотносительно стабильны; такие тяжелые металлы, как свинец, кадмий и медь,накапливаются в крови в основном в эритроцитах [397].
Лимфоциты, являющиесяосновным пулом мононуклеаров периферической крови, по концентрациимикроэлементов сходны с клетками органов и более точно отражают ихсодержание в организме [254]. Выбор волос в качестве второго биосубстратапозволяет дать ретроспективную оценку микроэлементного статуса, при этомколичество микроэлемента, который необратимо включается в растущий волос,пропорционален уровню микроэлемента в других тканях организма [149].Забор крови проводился в процедурном кабинете ГАУЗ «ООККВД» излоктевой вены в пластиковые пробирки BD Vacutainer с цитратом натрия,объемом 4,5 мл (Becton Dickinson and Company, США). Отбор волос проведенпутем срезания волос непосредственно у поверхности кожи волосистой частиголовы с 3 – 4 участков затылочной области.
Материалом для исследованияявились пробы волос длиной 2 – 4 см от прикорневой зоны. Волосыупаковывались в бумажный конверт и маркировались. Образцы для исследованияв день забора транспортировались в закрытом контейнере в санитарнохимическуюлабораториюФГБОУВО«Оренбургскийгосударственныймедицинский университет» Минздарва России.Решение поставленной в исследовании задачи проведения репликативногоанализа ассоциаций направлено на установление генетических факторов рискаГА. Для выполнение указанного анализа из международной базы данныхКаталогаопубликованныхгеномныхассоциативныхисследованийНационального института исследований генома человека (США) (The NHGRI-EBICatalog of published genome-wide association studies) [13] были отобраны восемьоднонуклеотидных полиморфизмов генов, ассоциированных по данным GWAS, сГА [298].
Они включали следующие однонуклеотидные полиморфизмы (ОНП):rs9275572 (ген HLA-DQA2), rs9479482 (ген ULBP3, ULBP6), rs1024161 (ген CTLA4,ICOS), rs3118470 (ген IL2RA), rs1701704 (IKZF4), rs7682241 (IL2 – IL21), rs694739(PRDX5), rs10760706 (STX17) (таблица 1).76Таблица 1 – Полиморфные маркеры генов, ассоциированных с гнезднойалопецией, и кодируемые ими белковые продуктыОНПХромосомнаялокализация гена6q25.1rs1024161ОбозначениегенаULBP3/ULBP6CTLA4/ICOSrs694739rs7682241PRDX5IL2/IL2111q13.14q27rs1701704IKZF412q13.2rs3118470IL2RA10p15.1rs9275572HLA-DQA26p21.32rs10760706STX179q31.1rs94794822q33.2Белковый продукт гена(код UniProt)UL16-связывающий белок 3 (Q9BZM4)/UL16-связывающий белок 6Белок 4, ассоциированный сцитотоксическими Т-лимфоцитами(P16410)/ Индуцируемый Т-клеточныйкостимулятор (Q9Y6W8)Пероксиредоксин-5 (P30044)Интерлейкин 2 (P60568)/ Интерлейкин 21(Q9HBE4)Цинк-пальцевый белок Eos семействатранскрипционных факторов Ikaros(Q9H2S9)альфа-цепь рецептора интерлейкина-2(P01589)Антиген главного комплексагистосовместимости II класса DQ альфа 2(P01906)Синтаксин-17 (P56962)Материалом для молекулярно-генетического исследования явились образцыкрови 105 пациентов с ГА и 100 здоровых лиц группы сравнения, забор которыхпроводился в пластиковые пробирки BD Vacutainer с ЭДТА, объемом 4,5 мл(Becton Dickinson and Company, США) в процедурном кабинете ГАУЗ ООККВД.Генотипирование проводилось методом аллель-специфической гибридизации вформате полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией врежиме реального времени (ТaqMan).
Исследование выполнялось в три этапа:выделение ДНК из исследуемого материала, ПЦР-амплификацию ДНК содновременной гибридизационно-флуоресцентной детекцией и интерпретациярезультатов. Выделение ДНК из лейкоцитов крови проводилось с использованиемКомплекта реагентов для выделения ДНК Проба ГС (ООО «НПО ДНКТехнология»). ПЦР-амплификация ДНК выполнена с использованием наборовдля определения указанных выше полиморфизмов генов, разработанных ипроизведенных научно-производственной компанией «Синтол».
В состав каждогонабора входили реактивы для амплификации ДНК (реакционная смесь 2,5×,77содержащая все необходимые компоненты для проведения ПЦР-РВ, разбавитель2,5×,TagДНК-полимераза),триположительныхконтрольныхобразца,соответствующие возможным генотипам, отрицательный контрольный образец иинструкция по применению. Введенные в реакционную смесь для амплификациисигнальные зонды, содержащие флуоресцентные метки Fam и Hex, на каждыйвариант определяемого генетического полиморфизма, позволяли одновременнодетектироватьдвааллеляводномобразце.Молекулярно-генетическоеисследование проведено на амплификаторе детектирующем «DTlite» (ООО «НПОДНК-Технология»).Для выявления функциональных взаимосвязей ассоциированных маркеров сизвестнымипатогенетическимимеханизмамиГАбылавыполненаихфункциональная аннотация на основе терминов базы данных Gene Ontology (GO)[8].
Указанная база данных содержит контролируемый иерархический словарьтерминов (онтологий) для описания молекулярных функций генов, биологическихпроцессов, в которых они участвуют, и клеточных компартментов, где генныепродукты активны [5, 536]. При этом использован подход, основанный наположенииотом,индентификациичтоанализбиологическихгруппыгеновпроцессов,повышаетвовлеченныхвероятностьвпатогенезисследуемого заболевания [370, 536]. Реализация указанного подхода былавыполнена с помощью биоинформационного ресурса Database for Annotation,Visualization,andIntegratedDiscovery(DAVID)[7],обеспечивающеговозможность интерпретации данных функциональной аннотации перечня генов,на основе анализа обогащения описания генов терминами из Gene Ontology (GOEnrichment Analisys) [328]. Анализ обогащения исследуемых генов терминами GOпроведен с учетом категории «биологические процессы», это обосновано тем, чтоданнаякатегорияобеспечиваютохватывает функциональныелучшуюбиологическуюописанияинтерпретацию,генов,которыеоснованнуюнамногокомпонентной сигнализации и функциональных группах [315].Для проведения анализа взаимодействия белковых продуктов генов,ассоциированных с ГА, использован ресурс STRING (Search Tool for Retrieval of78Interacting Gines/Proteins) [11].
Каждая пара белок-белковых взаимодействий вресурсе STRING имела доверительный уровень связи, который рассчитывался наоснове комбинации вероятностей белок-белковых взаимодействий из различныхисточников, таких как база данных KEGG (Kioto Encyclopedia of Genes andGenomes), данные литературы и функциональные данные геномики [534].Проведенныйбиоинформационныйанализбылдополненанализоммолекулярных путей. Основанием для этого служило предположение, чтооднонуклеотидные полиморфизмы генов, ассоциированных с заболеванием,объединенные одним путем, принимают совместное участие в патогенезе болезни[385]. Анализ молекулярных путей проведен с использованием базы данныхKEGG (Kioto Encyclopedia of Genes and Genomes) [9].Методымоделированиестатистическогоанализастатистическойиинформациимоделирования.проводилсясАнализипомощьюспециализированных пакетов прикладных программ SPSS 22.0 (SPSS Inc.,Chicago, IL, USA), Statistica 10.0 (StatSoft Inc., USA), Stata/SE 11.1, интерактивнойпрограммы расчета критерия 2 для таблиц сопряженности [462], стандартногопакета«Microsoft Excel».Во всех процедурах статистического анализакритическое значение уровня значимости принималось равным 0,05.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
