Диссертация (1139568), страница 13

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 13)

Хелатор63цинка N,N,N`,N`-тетракис (2-пиридилметил) этилендиамин (ТПЭН) («Sigma»,США) инъецировалсявнутрибрюшинно животнымVII опытной группыежедневно в дозе 8 мг/кг, при этом в качестве растворителя выступалатранспортная среда, состоящая из этанола, глицерина и воды, взятых всоотношении 1:3:6 [119]. Животные контрольной группы получали плацебо.На 17-й день эксперимента животным всех групп под эфирным наркозомбыла проведена индукция анагена (стадия роста волосяного фолликула) путемдепиляции волос с кожи спины [193] восковыми мини-полосками WaxStrips«Beautyformulas»(DrammockInternationalLTD.,Великобритания).Гистологически, функционально и макроскопически индуцированные депиляциейанагеновые фолликулы неотличимы от развивающихся спонтанно анагеновыхфолликулов [193].После индукции анагена регистрировались макроскопические измененияцвета кожи мышей в зоне депиляции, который у используемого вида мышейуказывает на стадию фолликула волоса [113].На 9-е сутки после депиляции 50% животных из каждой группы выводилисьиз эксперимента путем декапитации под эфирным наркозом.

Материалом длягистологического исследования являлись образцы кожи спины, подвергнутойдепиляции. Отбор исследуемого материала производился с межлопаточнойобласти, паравертебрально, начиная от линии, соединяющей основания лопатоклабораторных животных. Размер образцов кожи составлял 10×15 мм.

Дляпроведения световой микроскопии образцы кожи мышей после забора помещалив 10% нейтральный формалин и фиксировали при комнатной температуре втечение суток. После стандартной гистологической проводки материал заливали впарафин. Гистосрезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином Майера иэозином и по Ван-Гизону. Морфологические изменения в образцах кожиэкспериментальных животных выявлялись путем сравнения с материаломконтрольной группы. Оценка признаков дистрофии волосяных фолликулов данана основании предложенных M.

Maurer (1997) изменений [400], среди которыхучитывались внематриксные гранулы меланина (эктопированные в дермальный64сосочек и/или перифолликулярную дерму) и аномально раздутые каналы волоса.Оценка пролиферативной активности кератиноцитов покровного эпителия ипроизводных кожи основывалась на изучении характера экспрессии ядерногоантигена Ki-67 [6]. Использование Ki-67 в качестве маркера пролиферацииобусловлено его экспрессией только делящимися клетками и быстрым распадом,исключающим его накопление и обнаружение в покоящихся клетках [84].Определение экспрессии белка Ki-67 проведено на 9-е сутки после депиляции вовсехопытныхиконтрольнойгруппе.Дляэтогоиспользованиммуногистохимический метод с применением кроличьих моноклональныхантител к Ki-67 (clone SP6) (Cell marque, США).

Визуализацию Ki-67-позитивныхклеток производили согласно протоколу фирмы-производителя (Cell marque,США). Ki-67-позитивные клетки определялись по окрашенному в коричневыйцвет ядру. Подсчет Ki-67-позитивных клеток и общего количества клетокпроводили в 15 полях зрения при увеличении × 600. Для каждого поля зрениярассчитывали индекс пролиферации, который представляет собой долю Ki-67позитивных клеток к общему количеству клеток, выраженному в процентах [84].Апоптотические клетки выявлялись путем идентификации каспазы-3,являющейся ранним маркером апоптоза, который экспрессируется клетками всехтканей [82].

Выявление экспрессирующих каспазу-3 эпителиальных клетоквыполнено с использованием первичных антител Human CPP 32 (caspase-3) CloneJHM62 согласно протоколу фирмы-производителя (Spring BioScience, США).Подсчет клеток проводился не менее чем в 15 полях зрения при увеличении ×600.Каспаза-3-позитивные клетки определялись по темно-коричневой зернистости вядре и цитоплазме. Оценивались клетки покровного эпителия и эпителиальныеклетки волосяных фолликулов – наружной и внутренней оболочек влагалищафолликула волоса, без учета зоны матрикса, где из-за скопления гранул меланинамеченые ядра клеток трудно различимы. Для каждого поля зрения рассчитывалииндекс апоптоза, который представлял собой долю позитивно окрашенных клетокк общему количеству клеток, выраженному в процентах [82].65На 19-е сутки после депиляции из эксперимента выводились оставшиеся50% мышей из каждой группы.

Забор образцов кожи проводился описаннымвыше способом с подготовкой гистологических препаратов, окрашенныхгематоксилином Майера и эозином и по Ван-Гизону, для изучения насветооптическом уровне. Иммуногистохимический метод в этой серии опытов и вэти сроки не использовался.Сроки вывода животных из эксперимента были обусловлены стадиямицикла волосяных фолликулов. На 9-е сутки после депиляции кожа мышей линииC57BL/6 содержит анагеновые волосяные фолликулы, в которых происходятвыраженные пролиферативные процессы [113, 193].

На 19-е сутки последепиляции волосяные фолликулы находятся в стадии катагена (переходная фаза),характеризующаяся процессами инволюции волосяного фолликула [113, 193].Клинической базой исследования явилось ГАУЗ «Оренбургский областнойклинический кожно-венерологический диспансер», где было обследовано инаходилось на катамнестическом наблюдении 105 взрослых пациентов с ГА (39мужчин и 66 женщин, средний возраст 29,4±1,01). С учетом данных литературы ораспространенности ГА, составляющей 0,1 – 2,0% в общей популяции [138],необходимое число наблюдений вычислялось по формуле Сепетлиева Д.А. (1968):nt 2 pq, где2n – численность выборочной совокупности,p – удельный вес лиц, страдающих гнездной алопецией, равный 2,0%,q – величина, равная 100 – p, составившая 98%,Δ – предельно допустимая ошибка, равная 3%,t – доверительный коэффициент, равный 2.Проведенный расчет показал, что численность выборки пациентов должна бытьне менее 87 человек:n22  2  98 87 .32Критериями включения пациентов в исследование явились: установленный66диагноз ГА с наличием клинических проявлений болезни, возраст 18 лет истарше, принадлежность к коренным жителям г.

Оренбурга. С учетомпоставленных в исследовании задач, были установлены следующие критерииисключения: отсутствие клинических проявлений ГА, возраст младше 18 лет,прием пациентами поливитаминов или биологически активных добавок смикроэлементами, энтеросорбентов, мочегонных и слабительных средств впоследние 6 месяцев; наличие у пациентов металлических зубных протезов,применение общего и наружного лечения по поводу ГА; для женщин –беременность и лактация, прием оральных контрацептивов.Группа сравнения составила 100 человек (39 мужчин и 61 женщина,средний возраст 26,7±1,3 года).

Критериями включения в нее явились: возраст 18лет и старше, отсутствие в личном и семейном анамнезе указаний на ГА и другиеАИЗ,принадлежность ккореннымжителямг.Оренбурга.Критериямиисключения были следующие: возраст младше 18 лет, прием поливитаминов илибиологическиактивныхдобавоксмикроэлементами,энтеросорбентов,мочегонных и слабительных средств в последние 6 месяцев; наличие у пациентовметаллических зубных протезов; для женщин – беременность и лактация, приеморальных контрацептивов.Включение пациентов и лиц группы сравнения в исследование проводилосьпосле подписания ими «Информированного согласия на участие в исследовании».На каждого пациента оформлялась «Индивидуальная карта пациента», присоставлении которой за основу были приняты рекомендации Olsen E.

et al. (2004)[137]. Основными разделами «Индивидуальной карты пациента» явились раздел«Паспортные данные», «Анамнез заболевания», предусматривающий сведения одлительноститеченияпровоцирующемГА,факторе,числеэпизодов«Наследственныйзаболевания,анамнез»вероятномпациентов.Сборнаследственного анамнеза включал перечень заболеваний, рекомендованных дляизучения при ГА [137]: ГА, атопический дерматит, аллергический ринит, астма,аутоиммунный тиреоидит, диффузный токсический зоб, витилиго, сахарныйдиабет,краснаяволчанка,пернициознаяанемия,ревматоидныйартрит,67неспецифическийиммунодефицит,заболеванияязвенныйдругиеколит,целиакия,аутоиммунныеродственниковпервойипсориаз,болезни.второйПристепенисиндромэтомДауна,учитывалисьродства.Раздел«Дерматологический статус» включал описание выявленных у пациентовизменений кожи и ее придатков с формулировкой диагноза.

«Индивидуальнаякарта пациента» включала результаты проведенного обследования. С согласияпациентов проводилось фотодокументирование очагов поражения, которыеприлагались к «Индивидуальной карте пациента».Диагноз ГА выставлялся на основании клинических признаков заболевания,тяжесть ГА определялась в соответствии с классификацией Olsen E. et al. (2004)[137], в основу которой положена стандартизованная оценка выраженности всехклинических признаков ГА: площади выпадения волос на коже волосистой частиголовы S (scalp), степени выпадения волос на коже туловища и конечностей B(body) и изменений ногтевых пластин N (nail).

Характеристики

Список файлов диссертации