Диссертация (1139554), страница 47
Текст из файла (страница 47)
Для этого мышам подкожно и внутривенно были привиты опухолевые клетки EMT/6. После того как развилась опухоль была проведена ФДТ. Через 10 дней после ФДТ у мышей с дефицитомNK-клеток количество опухолевых очагов в легких было значительно выше,чем у животных из контрольной группы.
Авторы пришли к выводу, что NKклетки могут играть важную роль в ФДТ-индуцированном противоопухолевом иммунном ответе и контроле образования отдаленных метастазов. Крометого, было показано, что NK-клеточная АИТ является весьма эффективнымадъювантом при ФД лечении злокачественных опухолей EMT6 у иммунокомпетентных сингенных мышей BALB/c [237, 294]. Однако роль NK-клеток приФДТ является не до конца ясной и требует дальнейшего изучения.В последние годы стали появляться работы, в которых изучают эффектыфотосенсибилизаторов и ФД воздействия на индукцию NKG2D-лигандов молекул MICA на опухолевых клетках и увеличение цитотоксической активностиNK-клеток.
В единичных работах показано, что ФДТ индуцирует экспрессиюMICA на клетках аденокарциномы человека Colo205, клетках линии SNU-1 иSW-900 in vitro и на привитых опухолях CT26 у мышей in vivo [104, 294]. Адоптивный перенос NK-клеток мышам после ФДТ увеличивает долю лизированныхопухолевых клеток, таким образом, являясь хорошим методом ИТ воздействия вдополнении к ФДТ и существующей терапии. В цитотоксических тестах клетки247с повышенной экспрессией NKG2D-лигандов лизировались NK-клетками человека более эффективно, чем контрольные. Можно сделать вывод, что ФДТ положительно влияет на поверхностную экспрессию NKG2D лигандов на опухолевых клетках, таким образом, повышая их чувствительность к NK-клеточной цитотоксичности [294, 392].
Показано, что сублетальная ФДТ приводит к увеличению способности NK-клеток лизировать опухолевые клетки путем положительного регулирования NKG2D-лигандов. Предполагается, что эффект ФДТ можетчастично зависеть от индукции NKG2D-лигандов на опухолевых клетках, которые выжили после воздействия ФДТ и их восприимчивости к NK-клеткам черезассоциацию с адаптерными молекулами DAP10, которые воспринимают сигнал,возникающий при связывании рецептора NKG2D на поверхности лимфоцитов состресс-индуцированными молекулами MICA на поверхности клеток-мишеней, иосуществляют его дальнейшую передачу, индуцирующую цитотоксическое действие лимфоцита.
Таким образом, экспрессия стресс-индуцированных молекулприводит к иммунологическому уничтожению трансформированной клетки.Этот феномен может являться свидетельством активации врожденного звена иммунитета за счет физико-химических механизмов фотодинамического воздействия на иммунную систему человека и запуск каскадных реакций, приводящихк усилению противоопухолевого иммунного ответа в целом.Показано, что ФДТ вызывает многообразные иммунологические сдвиги впроцессе применения при противоопухолевой терапии [14]. Знание причин и закономерностей этих изменений позволит направленно их использовать для повышения эффективности комплексной терапии онкологических заболеваний.Дальнейшее изучение этих механизмов в регуляции функциональной активности эффекторных лимфоцитов человека поможет разобраться в процессахнаправленного воздействия ФДТ на адаптивный иммунный ответ, а также дастоснову для разработки новых терапевтических стратегий, основанных на сочетании использования свойств лимфоцитов и ФДТ при лечении злокачественных новообразований.248ЗАКЛЮЧЕНИЕДанное исследование направлено на выявление дисбаланса иммунологических показателей у онкологических больных за счет оценки факторовврожденного и адаптивного иммунитета и поиск путей коррекции с включением иммунотерапевтических подходов в протоколы лечения такой категориибольных.В работе показано, что в сыворотке крови онкологических больных с солидными новообразованиями многократно превышено содержание растворимых форм лигандов рецептора NKG2D и достоверно отличается от группыконтроля (р<0,002).
Значимые различия количества sMICA от контрольнойгруппы были выявлены при раке тела или шейки матки, предстательной железы, языка или гортани, молочной железы, желудка, КРР или меланоме(р<0,005). У больных меланомой с прогрессированием заболевания средняяконцентрация лигандов рецептора NKG2D в сыворотке крови в 2,8 раз выше,чем в группе со стабилизацией процесса (р=0,02). У больных КРР и меланомойвыявлено, что концентрация sMICA при III и IV стадиях заболевания достоверно выше, чем при I и II. Это свидетельствует в пользу того, что повышениеконцентрации sMICA в сыворотке крови больных может указывать на распространенный процесс и являться фактором негативного прогноза развития заболевания.Специфичность метода при солидных опухолях составила 96,7%. Длябольных КРР прогностичность положительного результата составила 91,7%, адля больных меланомой была несколько ниже – 83,3%.Повышенное содержание sMICA у больных КРР сопровождалось ростом доли NK-клеток и увеличением поверхностной экспрессии NKG2D налимфоцитах и NK-клетках по сравнению с контрольной группой.
Обратнаятенденция наблюдается с экспрессией NKG2D на всех лимфоцитах у больныхмеланомой. Выявлено снижение экспрессии маркера за счет популяции Т-лимфоцитов. Также у больных с многократным увеличением sMICA наблюдаетсязначимое повышение экспрессии CD95, что свидетельствует об их длительной249активации и готовности к апоптозу. Проявления этого процесса гибели клетокстановятся более значительными по мере роста опухоли и ПБ.В данном исследовании были сопоставлены субпопуляционные и фенотипические изменения лимфоцитов крови при различных онкологических заболеваниях и определены наиболее характерные особенности для больных с КРР имеланомой, происходящие в процессе развития опухоли.
У группы больных КРРвыявлено повышенное содержание NK-клеток, Тreg, активированных NKG2D+NK-клеток и CD69+ NK-клеток (р<0,05). У больных меланомой также повышеноабсолютное и относительное содержание Тreg и NKG2D+NK-клеток, содержаниеактивированных HLA-DR+ Т-лимфоцитов, экспрессия α-цепи рецептора IL-2(CD25) и активированных CD38+T-клеток.
По сравнению с группой больныхКРР у больных меланомой наблюдается повышение количества Т-клеток иCD3+CD38+ лимфоцитов. Данные изменения характеризуют в большей степениактивацию Т-лимфоцитов у больных меланомой и NK-клеток у больных КРР.Показано, что при онкологических заболеваниях не характерно изменениечисленности основных субпопуляций лимфоцитов, а достоверные измененияпроисходят в минорных субпопуляциях Treg, активированных NK- и Т-клетках,а также экспрессии маркера апоптоза.
Усиление экспрессии активационных маркеров CD25 у большинства больных при различных онкологических заболеваниях происходит за счет содержания Treg. Данные результаты могут служитьобоснованием для расширения общепринятой панели маркеров при фенотипировании лимфоцитов и оценки субпопуляционного состава лимфоцитов крови уонкологических больных с включением дополнительной оценки антигенов HLADR, CD38, CD25, CD69 и NKG2D.
Необходимо также определять долю Treg, какважной регуляторной субпопуляции лимфоцитов, отражающей проявление иммуносупрессии у онкологических больных в совокупности с концентрациейsMICA. Это может улучшить понимание механизма ускользания различных опухолей из-под иммунного надзора и ответа на терапию.250Выявлена взаимосвязь между уровнем sMICA и субпопуляционным составом лимфоцитов.
Показано, что с повышением уровня sMICA у больных меланомой увеличивается количество циркулирующих NK-клеток, однако у больныхКРР прослеживается обратная тенденция. Содержание рецептора NKG2D ичисло NK-клеток уменьшается с увеличением sMICA.Можно резюмировать, что уровень sMICA, экспрессия маркера апоптозаCD95 и альфа цепи рецептора IL-2 на лимфоцитах периферической крови, атакже количество Treg характеризуют проявление иммунодефицита и могут служить дополнительными диагностическими критериями у больных солиднымиопухолями и меланомой.Для подтверждения полученных данных и проверки гипотезы о том, чтоциркулирующий MICA может взаимодействовать с рецептором NKG2D в работе с помощью клеток-продуцентов СНО был синтезирован рекомбинантныйбелок MICA.
В экспериментальной модели с использованием rhMICA мы подтвердили, что в основе одной из причин неэффективности противоопухолевогоиммунного ответа лежит блокирование NKG2D+ лимфоцитов растворимымиформами молекул MICA, что приводит к снижению цитотоксической активности лимфоцитов. Было показано, что после активации лимфоцитов in vitro вприсутствии цитокинов IL-2 и IL-15 и последующем инкубировании их сrhMICA не происходит снижения уровня экспрессии NKG2D. Данный факт свидетельствует в пользу разработки метода активации цитотоксических лимфоцитов для их дальнейшего применения в протоколах АИТ у онкологическихбольных.Для того чтобы оценить влияние клеточной ИТ на состояние показателейиммунитета и содержание sMICA у онкологических больных первоначальнонами была предпринята попытка разработать способ активации лимфоцитовдля последующего применения его в клинической практике.В результате этой части работы был разработан способ активации лимфоцитов с использованием двух цитокинов (IL-2 и IL-15) в низких концентрациях,251который защищен патентом РФ на изобретение.
Он позволяет длительно культивировать МНК с сохранением высокой жизнеспособности, пролиферативной ифункциональной активности эффекторных клеток. Данный способ отличаетсяупрощенным способом проведения процедуры активации лимфоцитов in vitro,без разделения клеток на фракции и использования антигенов опухолевых клеток.Это позволило стандартизировать метод и облегчить его использование в клинической практике. Благодаря уменьшению концентраций цитокинов и их совместному добавлению к питательной среде, не содержащей белков животного происхождения, предложенный способ активации лимфоцитов и использование бесклеточного продукта для АИТ показал, что внутрикожное введение ЛАК- и ЦИКклеток безопасно, хорошо переносится и снижает выраженность побочных эффектов от ХТ. Это позволяет использовать данный способ активации лимфоцитовдля пациентов с сильно выраженным негативным ответом на введение IL-2 и других цитокинов, которые обычно используют для терапии в больших дозах.В результате внедрения АИТ в клиническую практику МРНЦ им.
А.Ф.Цыба были проведены исследования по оценке состояния онкологических больных после лечения с включением клеточной иммунотерапии. Результаты исследования показали объективный ответ на терапию только у больных меланомой в11,8% случаев, СБ наблюдалась в 41,2% случаев. У больных КРР СБ наблюдалась в 46,2% случаев. Объективного эффекта на АИТ получено не было, что характеризует данные опухоли как различные по иммуногенности. Показано, чтосопроводительная АИТ у больных с неблагоприятным прогнозом наиболее эффективна при минимальном объеме опухоли и при продолжительном (более 2-хмесяцев) и непрерывном проведении курсов АИТ.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
