Диссертация (1139542), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Предел обнаружения NO составлял 5-10ppb, диапазон измеряемых концентраций составлял – от 5 до 1000 ppb.Калибровка прибора проводилась не реже 1 раза в день. Методикакалибровки включала определение нулевого уровня в искусственном воздухебез добавления NO и 2-3 точек с калибровочными смесями NO и воздуха.Исследование системных маркеров воспаления и радикальногострессаИсследованиефункциональнойактивностигранулоцитовпериферической крови.Функциональную активность гранулоцитов исследовали методомспонтанной и индуцированной хемилюминесценции.
Данные исследованиябыли выполнены на кафедре микробиологии и иммунологии НижГМА (зав.кафедрой профессор А.Н. Маянский).Для исследования использовали венозную гепаринизировнную кровь,которую брали утром натощак в силиконированную посуду. В качествестимуляторов использовали:- зимозан (Латвия), опсонизированный пулом сывороток 20 здоровыхдоноров, воздействующий на С3в-рецепторы гранулоцитов; [84]- убитые бактериальные клетки Staphylococcus aureus, штамм 141,опсонизировнные IgG, воздействующие на Fcy – рецепторы клеток;[107]80-взвеськлетокStaphylococcusepidermidis,штамм178,взаимодействующий с лектиновыми рецепторами клеток.
[107]Для работы использовали кровь, как цельную, так и разведеннуюсредой 199 в соотношении 1:100. разведенную кровь помещали в количестве1,0 мл в силиконированные сцинтилляционные флаконы, добавляли 0,1 мллюминола (конечная концентрация 10-5 М), 0,1 мл физиологическогораствора при исследовании СХЛ и 0,1 мл стимулятора при исследованииИХЛ. Флаконы с содержимым инкубировали при температуре 37 Град С.Измерение хемилюминесцентной активности проб проводили на жидкостносцинтилляционном счетчике «Бета-2» (Киев) за 6 секунд в интегральномрежиме. Регистрацию ХЛ начинали через 10 минут после инкубации ипроводили в течение 40-60 минут с 10-минутным интервалом.
Посуду иреактивы подвергали темновой адаптации. Исследования проводили прикрасном свете. Результаты исследования выражали в импульсах световогопотока в минуту.Для исследования ХЛ отдельных фракций крови использовали двойнойградиент фиколла («Pharmacia», Швеция) – верографина («Spofa», Чехия) сплотностью 1,077 г/см3 и 1,123 г/см3. Гепаринизировнную кровь разбавлялисредой 199 в соотношении 3:1.
В центрифцжные пробирки последовательноналивали по 3,0 мл градиентов 1,123 г/см3 и 1,077 г/см3 и 3,0 мл разведеннойкрови. После центрифугирования (400 g, 45 минут, +4 Град. С) получали трислоя клеток. Верхний – мононуклеары, средний – гранулоциты, нижний –эритроциты.Слой мононуклеаров и слой гранулоцитов отсасывали пастеровскойпипеткой и помещали в различные пробирки. Каждую клеточную взвесьдважды отмывали раствором Хенкса, Мононуклеары при 200 G в течение 10минут, гранулоциты при 200 G в течение 2 минут и взвешивали в раствореХенкса, содержащем 0,01 % альбумина человека, в концентрации 5х105клеток в мл.
Мононуклеары и гранулоциты составляли более 96% клеток,жизнеспособность по типановому тесту составляла 98-99 %% (тест с81трипановымсинимпоказываетсвязанноеснекрозомувеличениепроницаемости наружной цитоплазматической мембраны). Все манипуляциис кровью и клетками проводили в силиконированной посуде. ИсследованиеСХЛ и ИХЛ мононуклеаров и гранулоцитов проводилось аналогичноисследованию разведенной крови.
В качестве стимулятора при исследованииХЛ клеточных фракций использовали опсонизированный зимозан.Исследованиехемилюминесценциислюны.Исследованиесистемного радикального стресса было проведено с использованиемпоказателей индуцированной ХЛ слюны. За основу метода были принятырекомендации, изложенные в работе Кузьминой Е.И. с соавт. «Применениеиндуцированной хемилюминесценции для оценки свободнорадикальныхреакцийвбиологическихсубстратах».Для[87]определенияхемилюминесцентных показателей слюны использовался прибор БХЛ-06М(НИИ «Биоавтоматика», Н.Новгород).Хемилюминесцентные параметры слюны исследовались в динамикезаболевания (в фазу обострения и в фазу ремиссии БА), в покое и поддействиемнагрузочныхпроб:гиповентиляции,гипервентиляции,физической нагрузки.Сборслюныпроизводилсястимулированнымспособом(сиспользованием жевательной резинки без содержания сахара) по методике,разработанной Комаровой Л.А.в количестве 5-10 мл в центрифужныепробирки.
[82]Слюнусобиралиутромнатощакпослевыполнениядетьмигигигенических процедур полости рта, в покое и после проведениянагрузочных проб (тестов с гиповентиляцией, гипервентиляцией, физическойнагрузкой). Различные виды нагрузочных проб проводились в разные дни,чтобы физиологические эффекты от их воздействия не накладывались другна друга.82Исследованиехемилюминесценциислюнывыполнялосьнепосредственно после забора проб. Собранная слюна центрифугировалась втечение 20 минут при 1500 об./мин.
Для исследования использоваласьнадосадочная фракция слюны.В измерительную кювету биохемилюминометра помещали: 1,0 мл слюны 100 мкл 0,01% раствора люминола на фосфатном буфере (1,36 гКН2РО4, 3,91г КСl на 0,5 л воды) 100мкл 0,0025М раствора FeSO4 (на том же буфере) 100мкл раствора H2O2 (вносился в кювету непосредственноперед измерением).Вспышка хемилюминесценции регистрировалась в течение 60 секунд.Результат в виде математической кривой регистрировался и обрабатывался спомощью компьютерной программы (НИИ «Биоавтоматика», Н.Новгород).Анализировались следующие показатели (рисунок 2.4.): Imax(mV),-пиковоезначениехемилюминесценции,отражаетпотенциальную способность исследуемой биологической системы кразвитию процесса СРО за данный отрезок времени (60сек).
Чем большевеличина показателя Imax, тем больше способность биологическойсистемы к развитию реакций СРО. S (светосумма) - площадь, очерченная кривой вспышки ХЛ и осьюабсцисс, обозначающей время. Этот показатель характеризует суммарнуюантиоксидантнуюактивностьзаданныйотрезоквремени.(Математическая зависимость S от антиоксидантной активности являетсяобратнопропорциональной:чемменьшеS,темвышеуровеньантиоксидантной активности). Imax/S, отношение пиковой интенсивности ХЛ к светосумме.
Позволяетоценить состояние свободнорадикальной системы СРО интегрально, вовзаимодействии оксидантных и антиоксидантных процессов.83Рисунок 2.4. Графическое изображение процесса хемилюминесценциибиосубстратов. [87]Статистическая обработка результатовСтатистическая обработка результатов выполнена с использованиемпакета программ “БИОСТАТ” и Statgraphics plus в соответствии срекомендациями, изложенными в монографиях. [39, 55]Данные представлялись в виде M±m, где М – среднее арифметическое,m–ошибкасреднегоилистандартноеотклонение(указановсоответствующих разделах). При нормальном распределении результатыоценивались с помощью критерия t Стьюдента для независимых и связанныхвыборок, при отсутствии нормального распределения – с помощью критерияКраскалл-Уоллиса W.
Для изучениясвязей между качественнымипризнаками применялся критерий χ2, а при недостаточном количестве членоввыборки – R-критерий Пирсона и Tau-b – критерий Кендалла. Для сравнениядвух независимых выборок использовался критерий Манна-Уитни U, прианализе различий между связанными выборками – критерий Вилкоксона.Достоверность различий оценивалась по критерию р (статистическизначимыми считались значения p<0,05).84ГЛАВА 3.
КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХБыло обследовано 654 пациента с атопической бронхиальной астмой ввозрасте от 5 до 17 лет, из них 474 мальчика (71%) и 180 девочек (29%),Средний возраст пациентов составил 12,92±2,72 лет. Из них у 366 детей(56,0%)быладиагностированалегкаяБА(интермиттирующаяиперсистирующая), у 253 пациента (38,7%) бронхиальная астма среднейтяжести и у 35 детей (5,3%) тяжелая бронхиальная астма.
Верификациядиагноза проводилась в соответствии рекомендациями Научно-практическойпрограммы"Бронхиальнаяастмаудетей:диагностика,лечениеипрофилактика" (1-4 издания) с учетом положений «Глобальной стратегиилечения и профилактики бронхиальной астмы» пересмотров 2002-2014 гг.Клиническая картина заболевания в целом была типична длярассматриваемой патологии. Как правило, пациентов и их родителейбеспокоили повторные преходящие эпизоды затрудненного дыхания,включая экспираторную одышку, «стеснение» в груди, кашель, отнавязчивого сухого до влажного, в том числе с трудно-отделяемой мокротой.Симптоматика могла иметь вариабельность в течение суток с ухудшением вночные и ранние утренние часы.
Триггерами симптомов и обострениязаболеваниявыступалипреимущественноОРВИ,холодныйвоздух,физическая нагрузка, смех, контакт с причинно-значимыми аллергенами.Периоды обострения заболевания характеризовались соответствующиминарушениямисамочувствия,-какправило,одышкойразличнойвыраженности, раздражающим кашлем, аускультативно – удлинениемвыдоха, полифоническими хрипами, включая свистящие.
Функциональноеисследование, как правило, позволяло подтвердить наличие бронхиальнойобструкции и продемонстрировать ее обратимость.Средипациентов,обследованныхвпроцессегоспитализации,отсутствие контроля бронхиальной астмы (диагноз клинически) илиобострение заболевания из числа обследованных было диагностировано у85402 пациентов, неполный контроль у 83 пациентов и у 92 пациентов имелместо полный контроль бронхиальной астмы или ремиссия заболевания(пациенты в периоде ремиссии находились на стационарном лечениипреимущественно в связи с проведением АСИТ).
Терапия пациентовсоответствовала периоду заболевания (уровню контроля), степени тяжестибронхиальной астмы и тяжести обострения (при его наличии), а также сучетом сопутствующей соматической патологии. Фармакотерапия периодаобострения проводилась в соответствии с имеющимися рекомендациями ивключала как ингаляционную терапию (бета-2-агонисты, М-холинолитики,ИГКС, муколитические препараты) с использованием различных системдоставок (дозированные аэрозоли, небулайзеры), так и системное введениелекарственных средств. [6, 36, 58, 104, 106, 109, 121, 166, 252] У части детейснедостаточным уровнем контролябронхиальнойастмы, имевшихклинические и лабораторные признаки хламидийной или микоплазменнойинфекции респираторного тракта, в комплекс терапии были включеныантибактериальные препараты группы макролидов.[273]Обращала на себя внимание коморбидность бронхиальной астмы сдругими вариантами соматической патологии.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
