Диссертация (1139537), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Лабораторные методы исследования2.3.1. Методики исследования углеводного обменаОпределение глюкозы в сыворотке крови проводили ферментативнымокислением в присутствии глюкозооксидазы (глюкозооксидазный метод) сиспользованием автоматического биохимического анализатора Vitalab Flexor E(Нидерланды)иреагентовфирмыDiaSys(Германия).Концентрациюгликированного гемоглобина крови (HbA1c) измеряли иммунотурбидиметрическимметодом на анализаторе Vitalab Flexor E (Нидерланды) с сенсибилизациейчастицами и непосредственным определением HbA1c без измерения общегогемоглобина.Инсулинкровиопределялинаавтоматическомиммунохемилюминесцентном анализаторе Immulite 2000 компании DiagnosticРroducts Сorporation (США). С-пептид крови также определяли с помощьюавтоматическогоиммунохемилюминесцентногоанализатораImmulite2000производства компании DPC (США) с использованием реагентов этой же фирмы.С-пептид - это устойчивый фрагмент эндогенно продуцируемого инсулина,«отрезаемый» от него при выделении в кровь.
Уровень С-пептида соответствуетуровню инсулина, выработанного в организме.Индекс HOMA-IR, как показатель инсулинорезистентности, рассчитывали поформуле, разработанной D. Matthews (1985): HOMA-IR = глюкоза натощак ·инсулин натощак / 22,5 (норма < 2,77).2.3.2. Методики исследования липидного обменаТриглицериды (ТГ) определяли в сыворотке крови энзиматическимферментативным методом на автоматическом биохимическом анализаторе VitalabFlexor E (Нидерланды) c использованием реактивов BioSystems (Испания).Холестерин общий (общий ХС) также определяли в сыворотке кровиэнзиматическим ферментативным методом на автоматическом биохимическоманализаторе Vitalab Flexor E (Нидерланды) c использованием реактивов,произведенных компанией Analyticon Biotechnologies AG (Германия).77Холестерин липопротеинов высокой плотности (ХС ЛПВП) определяли всыворотке крови энзиматическим ферментативным методом на автоматическомбиохимическом анализаторе Vitalab Flexor E (Нидерланды) с использованиемреактивов производства компании DiaSys (Германия).
Уровень холестериналипопротеинов низкой плотности (ХС ЛПНП) определяли расчетным методом поформуле W. Friedewald (1972 г.): ХС ЛПНП (ммоль/л) = (ХС общ – ХС ЛПВП) –ТГ/2,2.Дляоценкистепениатерогенностиплазмыкровииспользовалсяпредложенный А.Н. Климовым в 1977 году холестериновый коэффициентатерогенности (КА), который вычисляли по формуле: КА = (ХС общ – ХС ЛПВП)/ ХС ЛПВП.2.3.3. Методы исследования перекисного окисления липидов и системыантиоксидантной защитыОпределение общей окислительной способности сыворотки крови (ООС)проводили энзиматическим методом на анализаторе ИФА-ридер «Униплан»компании «Пикон» (Россия) с использованием реактивов фирмы Labor Diagnostika(Германия).Окисленные липопротеины низкой плотности (окисленные ЛПНП) измерялиметодом иммуноферментного анализа (ИФА) при помощи реактивов фирмыBiomedica(Германия).Абсорбцияпересчитываласьвконцентрациюпокалибровочному графику с использованием программного обеспечения ИФАридера «Униплан».Общую антиоксидантную способность сыворотки крови (OAС) такжеизмеряли на анализаторе ИФА-ридер «Униплан» фирмы «Пикон» (Россия) спомощью реактивов фирмы CanAg Diagnostics АВ (Швеция).Супероксиддисмутазу (СОД) (Cu/Zn-форма) определяли на анализатореИФА-ридер «Униплан», «Пикон» (Россия) с использованием реактивов фирмыBender MedSystem (Австрия).
Расчет проводили по калибровочной кривой, которая78строиласьпорезультатамизмеренияшестистандартныхобразцовсконцентрациями СОД соответственно: 5,0; 2,5; 1,25; 0,63; 0,31и 0,16 нг/мл.2.3.4. Методики исследования маркеров системного воспаления2.3.4.1. Методики определения циркулирующих цитокинов 1β, -4, -6, -8,ИНФ-γ и ФНО-αОпределение уровней интерлейкинов -1β, -4, -6, -8, интерферона-гамма ифактора некроза опухолей альфа основано на твердофазном «сэндвич» - вариантеиммуноферментного анализа с применением моно- и поликлональных антител,который проводили с помощью наборов реактивов ЗАО "Вектор-Бест" (Россия).2.3.4.2. Методики определения внутриклеточных цитокинов ИЛ-2, -4,ИНФ-γЗабор крови осуществляли из периферической вены в стерильнуюодноразовую пластиковую гепаринизированную пробирку.
Непосредственно послезабора материала и перед исследованием кровь тщательно перемешали на миниротаторе RS-24. Хранение крови перед исследованием не превышало 2-3 часов.Определениеинтерферона-гаммаконцентрациивинтерлейкина-2,лимфоцитахпроводилиинтерлейкина-4методомипроточнойцитофлуорометрии на анализаторе Су Flow производства компании Partec(Германия) с использованием реактивов фирмы Beckman Coulter (США).Индуцирование продукции внутриклеточных цитокинов лимфоцитамиосуществлялипутем добавленияфорбол-миристат-ацетата, активирующегопротеинкиназу С. Для повышения внутриклеточной концентрации кальция,необходимого для работы протеинкиназы С, в реакционную смесь добавлялираствор иономицина в диметилсульфоксиде.
Блокирование аппарата Гольджи,препятствующего выходу цитокинов из клеток в процессе культивации,осуществляли путем добавления в реакционную смесь раствора брефелдина А.В нашей работе выполнялся анализ индуцирования продукции ИЛ-2, ИЛ-4 иИНФ-γ в общей популяции Т-лимфоцитов, а также в Т-хелперах и Т-супрессорах.79Конечным результатом исследования являлся расчет процента Т-лимфоцитов, Тхелперов и Т-супрессоров, в которых был индуцирован синтез ИЛ-2, ИЛ-4 иИНФ-γ.2.3.5. Методики исследования нейрогормонального статусаИзмерение концентрации лептина в сыворотке крови осуществляли методомиммуноферментного анализа (ELISA) с использованием набора реагентовпроизводства компании DBC (США). В состав этого набора входит 2 видавысокоспецифических моноклональных антител: мобилизованные на лункахпланшета антитела к лептину и моноклональные антитела к особому эпитопулептина,связанныесбиотином.Величинаабсорбции,измеряемаянаиммуноферментном ридере «Униплан», «Пикон» (Россия), пропорциональнаконцентрации лептина в исследуемой сыворотке.
Пересчет оптической плотностив концентрацию осуществлялся с помощью калибраторов, входящих в состависпользуемого набора реагентов.Концентрациюкортизолавсывороткекровиопределялиметодомиммунохемилюминесценции на автоматическом анализаторе Immulite 2000 сиспользованиемреагентовпроизводствакомпанииDPC(нынеSiemens),(Германия). Контроль качества осуществлялся с использованием трех уровнейконтрольных материалов компании DPC (ныне Siemens), (Германия).Для определения адренокортикотропного гормона (АКТГ) венозную кровьотбирали в охлажденную во льду пластиковую одноразовую стерильную пробиркус этилендиаминтетрауксусной кислотой.
Концентрацию АКТГ в плазме кровиопределяли методом иммунохемилюминесцентного анализа на автоматическоманализаторе Immulite 2000 с использованием реагентов производства компанииDPC (ныне Siemens), (Германия). Концентрация АКТГ определялась путемсопоставления измеренной интенсивности люминесценции с многоточечнойкалибровочной кривой, построенной на основании анализа калибраторов сизвестной концентрацией искомого анолита. Контроль качества осуществляли с80использованием трех уровней контрольных материалов компании DPC (нынеSiemens), (Германия).Концентрациюβ-эндорфинаопределялииммуноферментнымметодом(ELISA) на плашечном ридере Униплан «Пикон» (Россия) с использованиемреактивов компании Peninsula Laboratories (США).
Метод определения основан навзаимодействии сыворотки крови с иммобилизованным в лунках 96-луночногомикропланшета биотинилированным трейсером, который впоследствии связывалсяс коньюгатом стрептавидин-пероксидазой хрена, образующим в свою очередь придобавлении тетраметилбензидина растворимый голубой продукт.
Интенсивностьокраски,пропорциональнойконцентрацииβ-эндорфина,определялифотометрически.2.4. Методы исследования психоэмоционального состояния2.4.1. Метод самооценки тревоги по шкале ЦунгаДляизмерениятревогииспользованашкаласамооценкитревоги,разработанная Цунгом (Zung W., 1980), обладающая всеми преимуществами шкалсамооценки: информация поступает непосредственно от пациента, заполнениешкалы требует мало времени, а сама процедура оценки очень проста и можетпроводиться при любых медицинских ситуациях. Шкала предназначена для оценкитревоги как клинического состояния, состоит из 20 пунктов. Измеряемыепоказатели: 5 пунктов оценивают аффективные симптомы, остальные 15 соматические.Методика применения: шкала заполняется пациентом около 3 минут послекраткогоинструктирования.Пациентапросятпоставитькрестикивсоответствующих ячейках бланка шкалы. Допускается выбор четырех степенейтяжести: очень редко, редко, часто, большую часть времени или постоянно.
Баллопределяется в соответствии с 4 градациями степени выраженности симптома покаждому пункту. Максимальный суммарный балл составляет 80. Уровни тревогипо данной клинической шкале подразделяются следующим образом: 20-40 баллов– низкий уровень тревоги; 41-60 баллов – средний уровень тревоги; 61-80 баллов -81высокий уровень тревоги.2.4.2. Метод самооценки депрессии по шкале ЦунгаДля самооценки депрессии применялась шкала Цунга (Zung Self-RatingDepression Scale), разработанная в университете Дюка (Zung W., 1965).
Тестпозволяет оценить уровень депрессии пациентов и определить степеньдепрессивного расстройства. При помощи шкалы Цунга испытуемый или врачмогут произвести самостоятельное обследование или скрининг депрессии. Тест«шкала Цунга» обладает высокой чувствительностью и специфичностью ипозволяет избежать дополнительных экономических и временных затрат,связанных с медицинским обследованием этических проблем.В тестировании учитывается 20 факторов, которые определяют четыреуровня депрессии. В тесте присутствуют десять позитивно сформулированных идесять негативно сформулированных вопросов. Каждый вопрос оценивается пошкале от 1 до 4 (на основе этих ответов: «никогда», «иногда», «часто»,«постоянно»). Результаты делятся на четыре диапазона: 25-49 - нормальноесостояние; 50-59 - легкая депрессия; 60-69 - умеренная депрессия; 70 и выше тяжелая депрессия.2.4.3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
