Диссертация (1139480), страница 12
Текст из файла (страница 12)
С одного блока готовили 15-20 предметныхстекол с серийными срезами. Срезы толщиной 4 мкм помещали на стеклаобработанные поли-L-лизином. Окрашивали гематоксилином Майера иэозином. В биоптатах слизистой оболочки десны оценивали степеньвыраженности воспалительных изменений по субъективным критериям сучетом клеточного состава и доминирующей локализации в пределахэпителиального компартмента и собственной пластинки слизистой оболочкидесны (таблица 2).Т а б л и ц а 2 - Степень выраженности воспалительных изменений вкомпартментах слизистой оболочки десны больных хроническимгенерализованным пародонтитом с учетом клеточного состава идоминирующей локализацииСтепень инфильтрации нейтрофильными лейкоцитамиСлабаяУмереннаяВыраженнаяМинимальноеДиффузнаяИнфильтрацияколичествоинфильтрациянейтрофильныминейтрофильныхнейтрофильнымилейкоцитамилейкоцитов влейкоцитамикомпартментов слизистойкомпартментахкомпартментовоболочки десны сслизистой оболочки слизистой оболочкифокальными некрозами идесныдесны, без признаковформированиеммассивного разрушения микроабсцессовСтепень инфильтрации мононуклеарными клеткамиСлабаяУмереннаяВыраженнаяСкудный инфильтрат ПлотныйПлотный диффузныйв собственнойдиффузныйинфильтрат, имеютсяпластинке слизистоймононуклеарныйскопления клеток,оболочки десны, чаще инфильтратнапоминающиевокруг сосудовлимфоидные фолликулы64Микроскопия биоптатов и фотографирование наиболее показательныхполей зрения осуществляли на фотомикроскопе CarlZeizz, Germany (Axioskop40, AxiocamMRC 5).использовали для обработки не более 20 стекол.
После промываниясрезов в дистиллированной воде (5 минут) и помещения их в трис-буфер на 5минут с целью повышения специфичности реакции проводили демаскировкуантигенов в водяной бане при температуре 900 -950 С в течение 45 минут.Давали срезам остыть до комнатной температуры, помещая их в трис-буферна 20-25 минут.С целью уменьшения фона и снижения неспецифического окрашиванияосуществляли блокирование эндогенной пероксидазы 3%-ным растворомперекиси водорода в течение 5 минут и обработкой протеин-блоком - 20минут.
В дальнейшем проводили инкубацию с первичными антителами - 60мин (370С), после которой срезы помещали в трис-буфер – 3 порции по 5 мин.Затем срезы обрабатывали вторыми (биотилинированными) антителами - 20минут и инкубировали со стрептавидин-биотин-пероксидазным комплексом втечение 20 минут. Дальнейшая окраска хромогеном осуществлялась подвизуальным контролем в течение 5-30 минут.Т а б л и ц а 3 - Панель антител, использованных в работеМаркерКлон (производитель)Биологическая рольKi67MIB-1(“DakoCytomation”)Ядерный маркер пролиферацииDO-7 (“DakoCytomation”)Ядерный маркер поврежденияP53ДНКCD41F6 («Diagnostic Bio Systems») Маркер Т-лимфоцита-хелпера144B(«Diagnostic BioCD8Маркер Т-лимфоцит-киллерSystems»)CD20L26(“DakoCytomation”)Маркер В-лимфоцитаCD68PG-M1 (“DakoCytomation”)Маркер макрофагов/моноцитовCDRO45 PG-M1 (“DakoCytomation”)Маркер Т-лимфоцит-памятиЭкспрессию вышеуказанных маркеров исследовали по характерураспределения метки в различных отделах десны, субъективно оценивалиинтенсивность метки.Для получения объективных данных использовали65морфометрическиеметоды.Вбиоптатахобработанныхиммуногистохимическим методом при увеличении 640 случайным образомвыбирали 6-10 полей зрения и подсчитывали количество позитивноокрашенных клеток.
Полученные значения пересчитывали на 1 мм2 среза. Вкачестве докраски использовали гематоксилин Майера.2.2.4 Морфометрические методы.С целью повышения объективности оценки степени выраженностиакантоза вычисляли удельный объем многослойного плоского эпителия (Vv).Для этого применяли окулярную вставку в виде квадратной сетки на 100единиц, шагом 0,01мм. Принимая узлы сетки за точки, подсчитываликоличество точек попавших на акантотические тяжи к общему числу точекпопавших на препарат при увеличении 140 в 8 полях зрения. В биоптатахобработанных иммуногистохимическим методом при увеличении 340случайным образом выбирали 6-10 полей зрения и подсчитывали количествопозитивно окрашенных клеток.
Полученные значения пересчитывали на 1 мм2среза.2.2.5 ПЦР-метод. Исследование полиморфизма генов цитокинов.Генетический метод исследования (метод полимеразной цепнойреакции) применяли для исследования полиморфизма следующих генов IL-1β(IL-1β C-511T, C+3953T), рецепторного антагониста интерлейкина-1 (IL-1RNVNTR во 2 интроне), фактора некроза опухолей-α (TNF-α G-308A),интерлейкина-4 (VNTR в 3 интроне IL-4) в лейкоцитах периферической крови.Проводился забор венозной крови (4-5 мл) с антикоагулянтом ипоследующим получением взвеси лейкоцитов, из которой выделяли ДНКметодом фенол-хлороформной экстракции с этанольным осаждением (JohnsM., Paulus-Thomas J., 1989).
Для определения полиморфных локусов C+3953T,C-511T гена IL-1β и VNTR-полиморфизма во 2 интроне гена IL-1RNиспользовали коммерческие наборы, производимые Институтом химическойбиологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск). ДляопределенияполиморфныхлокусовG-308AгенаTNF-αиVNTR-66полиморфизма в 3 интроне гена IL-4 использовались наборы «SNP-экспресс»(НПФ «Литех», Москва). Этапы выделения, амплификации ДНК, рестрикциии детекции продуктов амплификации выполнялись в соответствии стребованиями,выполнялсянауказываемымитермоциклерепроизводителем.«Терцик»Этапамплификации(ДНК-технология,Москва).Исследование выполнено в лаборатории кафедры патологической анатомииОмской государственной медицинской академии с участием д.б.н. профессораПоморгайло Е.Г.Т а б л и ц а 4 - Полиморфные сайты генов цитокинов, которые изучались вданной работеГенХромосома2g132g13SNP,VNTRC-511TC+3953TIL1RN2g14.2VNTR(интрон2)TNFα6p 21.3G-308AIL-45g 31.1VNTR(интрон3)IL-1βIL-1βИдентификат Эффекты цитокинаор db SNPrs 16944Провоспалительныйцитокин.
Активирует Тrs 1143634лимфоциты, остеокласты,ММПrs 2234663Конкурентно блокируетрецептор для IL-1β, невызывает биологическихэффектовrs 1800629Активирует остеокласты,ММП, экспрессию HLA IIантигенпрезентирующимиклетками, повышаетэкспрессию молекулмежклеточной адгезииrs 79071878Снижает продукциюпровоспалительныхцитокинов, способствуетдифференцировке Влимфоцитов и продукцииантител2.3 Статистические методы исследованияСтатистическиеданныепредставляютсобойнаблюдаемыеилиизмеряемые значения одного или нескольких признаков обследуемойсовокупности объектов.
Статистические инструменты данного исследования67включает унифицированные методы и способы, применяемые в медицинскихи медико-биологических исследованиях [76, 77, 136].2.3.1 Методы описательной статистики.Анализ данных начинали с проверки нормальности распределениявероятности случайных величин в сравниваемых группах. При нормальномтипе распределения (средняя арифметическая (М) и медиана (Ме) отличалисьменьше, чем на 10%) в качестве основных характеристик описательнойстатистики использовались средняя (μ) и стандартное отклонение (δ),отражающие центральную тенденцию и вариабельность значений выборки.
Втом случае, если распределение отличалось от нормального (разница М и Месоставляла более 10%), указывались Ме, нижний 25-й (L) и верхний 75-й (H)квантили [7, 34, 92, 136].2.3.2 Методы вариационной статистики.Для анализа достоверности различий между группами использовалиследующиекритерии.Принормальномраспределенияиспользовалипараметрические критерии: парный t- критерий для двух связанных выборок(группа пациентов до и после проведения противомикробной терапии) и tкритерий для двух независимых выборок (опытные и контрольная группы долечения).
Для сравнительной оценки переменных 3-х групп вводилсяпоправочный коэффициент Бонферони, который составил 1,7% (критическийуровень значимости – 5% / количество независимых групп сравнения - 3). Вслучае, если распределение отличалось от нормального использовалисьнепараметрические критерии: категориальные данные – критерий хи-квадрат(χ2) с поправкой на непрерывность Иэйтса для таблицы сопряженности 2x2,числовые данные – U-критерий Манна – Уитни для 2-х независимых выборок(опытные и контрольная группы до лечения) и критерий Фридмана (F) дляоценки более чем 2-х переменных в согласованных выборках, критерийранговых сумм Вилкоксона – для 2-х связанных выборок (группа пациентовдо и после проведения противомикробной терапии).
При множественномсравнении (3 группы) применялся непараметрический критерий Данна. Для68анализа достоверности различий между переменными использовали: методальтернативного варьирования при сравнении альтернативных переменных(долей признака). Для корреляционного анализа степени связи между двумяпеременными использовали коэффициент корреляции Пирсона (r- длястатистической корреляции) и коэффициент ранговой корреляции Спирмена(ρ) [7, 34, 92].Распределение наблюдаемых частоты аллелей и генотипов генов IL-1β,IL-1RN, TNFα, IL-4 в исследуемой и контрольной группах соответствовалотеоретически ожидаемым по закону Харди - Вайнберга.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
