А.Т. Мокроносова - Малый практикум по физиологии растений (1134226), страница 23
Текст из файла (страница 23)
Клетки, предназначенные для газометрического анализа, суспензируют в растворе сахаровы нз расчета 250 — 300 мг/мл. В каждый сосудик вносят по 2 мл суспензии. При работе с семенами для каждого сосудика берут навеску 0,3 — 0,5 г. То же делают н при работе с каллусом. 2. Заполнение сосудиков Вирбурга, Растительный материал вносят в основной объем сосудика, Два сосудика Варбурга с растительным материалом используют для определения поглощения кислорода. В центральный цилиндр этих сосудиков вносят 0,5 мл КОН для поглощения выделяющегося при дыхании СОя. Два сосудика с растительным материалом используют для определения суммарного газообмепа.
Центральный цилиндр этих сосудиков заполняют 0,5 мл дистиллированной воды. Кроме сосудиков с растительным материалом готовят термобарометры (вместо растительного материала вносят раствор сахаровы или фосфатный буфер, в центральный сосудик вносят 0,5 мл КОН или 0,5 мл воды) . В центральные цилиндры всех сосудиков вставляют фитили из фильтровальпой бумаги, сложенные гармошкой (квадрат примерно 2Х2 см), с тем чтобы увеличить площадь соприкосновения газовой фазы с КОН или водой. Заполненные сосудики закрепляют на соответствующих манометрах, следя за тем, чтобы шлифы были хорошо притерты (до прозрачной поверхности шлифа). Для этого шлифы манометров предварительно смазывают специальной смазкой. 3.
Лроведение опыта Описание прибора Варбурга и порядок работы на нем представлены в Приложении П. Манометры (с открытылги кранами) устанавливают в специальные держатели прибора Варбурга и включают качание. Измерение газового давления начинают только через 20 — 30 мин. Для начала отсчета устанавливают уровень манометрической жидкости в правом колене на деление 15 и записывают показания с левого колена манометра. Затем закрывают краны манометров и снова включают качание. Через каждые 20 мин в течение 1 ч манометры останавливают и снимают показания.
Для этого отключают качание; не открывая крана, уровень жидкости в правом колене устанавливают на метке 15 с помощью винта на резервуаре с манометрической жидкостью и снимают показания с левого колена. Данные заносят в таблицу. После окончания опыта открывают краньг манометров После этого вынимают манометры из ванны и ставят их на специальные подставки. Снимают сосудики с манометров и извлекают из них растительные пробы и жидкость. Вакуумную смазку снимают со шлифов манометра ватой, смоченной толуолом.
4. Расчет интенсивности газообмена Учитывая исходное йа (нулевое) показание манометров. определяют величину смещения уровня манометрической жидкости за время опыта, Вводят поправки на показания термобарометра; берут арифметическую разность между показаниями опытного сосудика и термобарометра. Умножив полученное после поправки на термобарометр значение й на константу сосудика, получают количество поглогдепиого кислорода. В табл. 17 приведен пример записи результатов опыта. На основании данных, полученных для двух видов сосуди"ов (с КОН н без КОН), рассчитывают количества выделенного СОз и поглощенного О: в микролитрах па ! г сырой массы за 1 ч (способ расчета см.
выше). Вычисляют величину ДК. е тя от ".о з' хв. В х о "х ах хо ,хх Их Ь- бо хо н-~- ыо Чх х о й х. х х о ох а о о а х х ю „,' о аз а о оно ха о а, охи я Оформление работы. См. равд, 1, задача 1. Результаты запишите в табл. !7. Рассчитайте интенсивность дыхания и ДК. В выводах отметьте действие исследуемого фактора на интенсивность поглощения кислорода и ДК. РАБОТА 2.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕЙ ИНТЕНСИВНОСТИ ДЫХАНИЯ ЦЕЛЫХ ПРОРОСТКОВ ИЛИ ОТДЕЛЕННЫХ ЛИСТЬЕВ ПОЛЯРОГРАФИЧЕСКИМ МЕТОДОМ Полярогр афический метод определения интенсивности дыхания основан на измерении скорости поглощения кислорода проростками с использованием закрытого электрода Кларка. Теория метода описана в задаче 4 равд.
1~1. Цель работы. Определить интенсивность дыхания полярографическим методом у растений разного вида и возраста, выращенных в различных условиях. Реактивы и оборудование: полярографнческая установка с закрытым влектродом Кларка; сушильные шкафы (108 и 80'С); аналитические весы; зксикатор; миллиметровая бумага. Объект исследования: проросткн пшеницы, гороха, кукурузы различного возраста; проростки пшеницы, вырашенные в различных условиях водоснабжения.
Ход работы. Полярографическая установка для определения интенсивности дыхания и фотосинтеза целых проростков и порядок работы на ней описаны в Приложении П. Исследуемые растения помещают в специальные камеры, герметично закрывают крышками, устанавливают на штативе и подключают компрессор. Включают самописец и ааписывают скорость изменения концентрации кислорода на многоканальном самописце в течение 10 — !5 мин. После регистрации интенсивности дыхания отделяют части растений, взвешивают их на аналитических весах в бумажных пакетиках !пакетики предварительно также взвешены ца аналитических весах).
Определяют сырую массу растений. Пакетики с растениями помещают в сушильный шкаф при температуре 105'С на 15 — -20 мин, после чего пробы переносят в сушильный шкаф на ВО'С и доводят до постоянной массы. Определяют сухую массу растений, взвешивая растения с пакетиком и отдельно пакетик. Расчет интенсивности дыхания производят, как описано в задаче 1 равд. П1, и выражают в микромолях О, на 1 г сырой массы за 1 ч и микромолях О, на ! г сухой массы за 1 ч. Оформление работы.
См. равд. 1, задача 1 Сделайте выводы о влиянии физиологического состояния растений на иьпенснвность дыхания. ЗАДАЧА 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ НЕКОТОРЫХ ОКИСЛИТЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ ют Окислительные процессы в растительной клетке охватыва- т все известные механизмы окисления. е 99 нн'., -Н, с СН нс с ОН ОН ннт дденин НФ с 'Ъ С М сн с с Ъаь~' Ж СН, о=с с. с~ с — с::. ! ны с~ ~с с — си с н с Н фаааинадениндннукаеетид Сфд, НΠ— Р=О О НС С вЂ” СОХНт 1) НС, СН НΠ— Р=О ! О— Ннкеткнамид Ннкетинамидаденнндинткнеетид Ьидд Ь 101 100 1. Окисление по типу отнятия электронов (подобно реакции — е г егч.— ~.Ген ь) . 2. Окисление по типу отнятия водорода (подобно реакции -гн СН3 СНа а СНг= СНг) .
3, Окнслеьте путем присоединения к субстрату кислорода (подобно реакции 2СО+О~- 2СО,). Таким образом, окисление может происходить как с участием кислорода в реакции, так и без него. Окислительные процессы катализируют ферменты. Все окислительные ферменты принято делить в зависимостн от механизма окисления на дегидрогенаэы, оксидазы и оксигеназы. Кроме того, в митохондриях клеток содержится группа фермен тов — продьежуточных переносчиков электронов ЭТЦ дыхания, Дегидрогеиазы. Ферменты этой группы окисляют субстрат путем отнятия водорода. При широком разнообразии апофермептов, позволяющих окислять широкий спектр субстратов, коферментная часть дегидрогеназ представлена либо пиридиновыми нуклеотидами (НЛД или НЛДФ), либо флавиновыми нуклеотидами (ФМН, ФЛД).
Соответственно различают пиридиновые и флавиновые дегидрогеназы; ьго — Р=О 1 О НΠ— Р-.но О 1" носи ! НОСН посн Пирндиновые дегидрогеназы являются анаэробными ферментами, они не способны к последующей передаче восстановительного эквивалента на кислород. Окислительно-восстановительный потенциал этих дегидрогеназ составляет — 0,32 В. К НАД-зависимым дегидрогеназам относят лактатдегидрогеназу, малатдегидрогеназу, изоцитратдегидрогеназу, к НАДФ- зависимым — глюкозо-б-фосфатдегидрогеназу, б-фосфоглюконатдегидрогеназу. Флавиновые дегидрогеназы могут быть и анаэробными, и аэробными.
Окисление с участием флавиновых дегидрогеназ аэробного типа, как правило, ведет к образованию пероксида водорода. Эти дегидрогеназы могут быть названы и оксидазами из-за их взаимодействия с кислородом, Примером анаэробной флавиновой дегидрогеназы может служить сукцинатдегидроге- паза, аэробпых — оксидаза гликолевой кислоты, оксидаза 1.-ами нокислот. Флавиновые дегидрогеназы отличаются большим разнообразием окислительно-восстановительного потенциала, оии нередко содержат металлы — медь, молибден, железо.
Оксидазы. Ферменты, осуществляющие окисление путем передачи восстановительного эквивалента от субстрата либо на молекулярный кислород, либо на кислород пероксида водорода или органических перекисей. Ферменты группы оксидаз широко представлены в растительных клетках. Они участвуют в процессе дыхания на терминальной его стадии передачи электронов на кислород в ЭТЦ митохондрий. Ферментами, осуществляющими эту реакцию, являются цитохромоксидаза и альтернативная оксидаза, не чувствительная к цианидам. Однако ббльшая часть оксидаз катализирует реакции окисления, не связанные с дыхательной цепью митохондрий. Они завершают многие окислительные процессы, происходящие вне митохондрий. Вклад этих реакций в общее потребление кислорода в растгительных организмах сравнительно невелик, однако они несут большую метаболическую нагрузку в растении.
Субстратами оксидаз могут служить ароматические вещества, фенолы, аскорбиновая кислота и др. Они составляют так называемую группу альтернативных онсидпз (рис. 18) гк, Мгкн .-Нпм - "—- пений, расщепляют алифатические соединения. Это белки, содержащие, как правило, негеминовое железо, однако существуют оксигеназы, содержащие гем (триптофандиоксигеназа), либо вообще не имеющие железа (липоксигеназа).
Ряд оксидаз (полифенолоксидаза, пероксидаза) могут осуществлять оксигеиазную функцию. Промежуточные переносчики электронов. Эти соединения входят в состав электрон-транспортной цепи митохондрий и осуществляют перенос на кислород электронов от НАД.Н или ФАД Н,. Среди них выделяют группу цитохромов (цитохромы групп а, Ь и с), содержащих геминовое железо, группу железо- серных белков, содержащих негеминовое железо, а также переносчики типа хинонов (убихинон). Электрон-транспортная цепь митохондрий растений представлена на рис. 19.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
