А.Т. Мокроносова - Малый практикум по физиологии растений (1134226), страница 25
Текст из файла (страница 25)
Объект исследования: листья и корни проростков гороха разного возраста. Ход работы. Навеску растительного материала (50 — 100 мг) растирают в ступке с небольшим количеством (1Π— 15 мл) фосфатного буфера. Растертую массу переносят количественно в мерную колбу на 50 мл, доводят пробу буфером точно до метки, хорошо перемешивают и оставляют на 1Π— 15 мин. Затем раствор фильтруют через днойнон бумажный фильтр нли центрифугируют 10 мин при 4000 обтмин. Фильтрат (или надосадочную жидкость) используют для определения активности фермента.
Лктивность фермента исследуют на ФЭКе (К=440 нм). Об активности фермента судят по времени развития окраски до определенного значения оптической плотности (значение 0 выбирают в зависимости от скорости развития окраски в пределах от 0,25 до 0,4). Для анализа каждой биологической пробы используют трн одинаковые кюветы ФЭКа: одна — контрольная, две другие— опытные (две аналитические повторности из одной биологической пробы).
Во все три кюветы вносят: 2 мл вытяжки; 2 мл буферного раствора, 2 мл гнаякола. Затем в контрольную кювету приливают 2 мл воды и устанавливают ее в контрольную (далыиою) кюветную подставку ФЭКа. Вводят ее н световой луч. Закрывают кюветную камеру н ручками грубой и тонкой наводки устанавливают нуль на шкале оптической плотности по контрольному образцу. Затем одну из опытных кювет ставят в держатель и вводят ее в световой луч. Автоматической пипеткой вносят в опытную кювету 2 мл Раствора 11гО, и однонремепно ьключают секундомер. Пробу хорошо перемешивают стеклянной палочкой. Затем закрывают кюветную камеру и по шкале оптической плотности следят за Разв итием окраски.
Замечают по секундомеру время достижения необходимой оптической плотности. 107 Аналогично производят измерения для второй опытной кюветы. Расчет активности ведут по формуле (» айт А= где А — активность, выра>кеннан в относительных единицах на 1 г сырой массы за 1 с; .0 — зарегистрированная в опыте оптическая плотность; 1 — время, с; с( — толщина слоя жидкости (толщина кюветы), см; а, (1, у — факторы разведения: и — отношение количества жидкости, взятой для приготовления вытяжки, мл, к массе навески, г; 0 — степень дополнительного разведения вытяжки после центрифугирования (если это требовалось); Т вЂ” степень постоянного разведения вытяжки в кювете (в наших условиях равна 4). Оформление работы.
См. равд. 1, задача 1. Результаты представьте в виде таблицы. Сделайте выводы о зависимости активности фермента от исследуемых физиологических факторов. РАБОТА 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПОЛИФЕНОЛОКСИДАЗЫ В РАСТИТЕЛЫ1ЫХ ТКАНЯХ (ПО БОЯРКИНУ) 17олифенолоксидаза (ПФО), известная также как катехолоксидаза, фенолоксидаза или о-дифенол: кислород оксидоредуктаза (КФ 1.10.3.1) катализирует окисление о-дифенолов до о-дихинонов (дифенолоксидазная, или катехолазная, активность, см. уравнение 1), а также о-гидроксилирование монофеиолов (монофенолгидроксилазная, или крезолазная, активность, см.
уравнение 2). о ! + н,о лоты, пирокатехин и другие о-дифенолы, Полагают, что ПФО существляет окисление по одноэлектронному механизму. Это опряжено с образованием свободных радикалов субстратов вакцин, а также, возможно, с возникновением активированных форм кислорода. Оптимум активности рН лежит в довольно ,яироких пределах (РН 5,0 — 7,0). Характерной особенностью фермента является низкое сродство к кислороду; поэтому для выявления максимальной активности фермента необходима хоро ая аэрации субе ра ов Катехолоксидаза — наиболее изученная и превалирующая форма феполоксидазы в растениях. В клетках высших растений ПФО локализована в основном в пластидах всех типов (в хлоропластах, лейкопластах) и находится в латентном состоянии (прополнфенолоксидаза).
Активация латентной формы ПФО происходит при действии детергентов, жирных кислот, протеаз и некоторых других воздействиях. Физиологическая роль ПФО остается недостаточно ясной. Показано изменение ее активности в онтогенезе растений (активация ПФО при старении), при повреждениях и патогенезе. Активность ПФО может быть определена измерением скорости окисления фенолов (в ультрафиолетовой области спектра) или по образованию окрашенных продуктов.
Однако механизм реакции сложен; оп связан с образованием ряда последующих полимерных продуктов. поэтому определение активности фермента по скорости развития окраски в реакционной смеси возможно лишь на коротком начальном этапе реакции. Более удачным является определение активности ПФО по развитию окраски в окислительно-восстановительных реакциях, сопряженных с окислением фенолов, С этой целью используют систему пирокатехин-р-фенилендиамин или пирокатехин-днэтил-р-фенилендиамин. Реакция протекает следую»цим образом; (!» -Хинин Пирокасскин р»Н мн он он (2» мн мн о-Хинин рирсвиномлиамвн Окраоссннни вролукк !»ирокак".лм 109 108 О Н о Г'1 оу ~ О + ИО Только катехолоксидаза (ПФО) способна осуществлять о-гидроксилирование фенолов. Обычно в норме дифенолоксидазная активность значительно превышает монофенолгидроксилазную активность этого фермента.
Гидроксилирование и окисление составляют две главные реакции в синтезе и расщеплении фенолов растения. Полифенолоксидаза — медьсодержащий фермент, субстратами которого могут быть катехол, хлорогеновая, галловая кя- о !! иво, Цель работы. Определить активность полифенолоксидазы в различных частях растений н изменение ее активности с возрастом растительных тканей.
Реактивы и оборудование: 1)15 М фосфатный буфер, рь! 7,0 — 7,4; !е)е.й раствор пнрокатехина (саежеприготавлеиный); 0,02'л-и раствор диметнл-р. фенилендиамииа в воде (свежеприготовленный); фарфоровые ступки с пестиком; мерные колбы объемом 25 мл; стеклянные стаканы объемом 50 н !00 мл; средние стеклянные воронки; пипетки объемам 2 и 5 мл; автоматические пипетки; бумажные фильтры; ФЭК (КФК-2-УХЛ4.2); стеклянные кюветы к ФЭКу толп|иной 2 см. Объект исследования: листья и корни проростков гороха различного возраста. Ход работы. Навеску растительного материала (250 — 500 мг) растирают в ступке с небольшим количеством (10 — 15 мл) фосфатного буфера. Растертую массу переносят количественно в мерную колбу, доводят буфером точно до метки, хорошо перемешивают и оставляют на 10 — 15 мин.
Затем раствор фильтруют через двойной бумажный фильтр или центрифугнруют 10 мин при 4000 об)мип. Фильтрат (или надосадочную жидкость) используют для определения активности фермента. Активность фермента исследуют фотометрически па ФЭКе (А=590 нм). Об активности фермента судят по времени развития окраски до определенной оптической плоп|ости (значение оптической плотности — Й вЂ” выбирают в зависимости от скорости образования окраски в пределах от 0,025 до 0,4). Для анализа каждой биологической пробы нспользуют три одинаковые кюветы для ФЭКа; одну контрольную н две опытные (две аналитические повторности из одной биологической пробы).
Во все три кюветы вносят: 2 мл вытяжки, 2 мл буферного раствора, 2 мл диметил-р-фенилепдиамина. Затем в контрольную кювету приливают 2 мл воды, устанавливают ее в контрольную (дальнюю) подставку ФЭКа и вводят в световой луч. Закрывают кюветную камеру и ручками грубой и тонкой регулировки устанавливают нуль на шкале оптической плотности по контрольному образцу. Одну из опытных кювет ставят в держатель и вводят ее в световой луч. Автоматической пипеткой добавляют в опытную кювету 2 мл раствора пирокатехина и одновреж!еьно включают секундомер.
Пробу хорошо перемсп|ивают стеклянной палочкой. Затем закрывают кюветную камеру и следят за развитием окраски по шкале оптической плотности. Замечают по секундомеру время достижения необходимой оптической плотности. Аналогичные изменения производят и для второй опытной кюветы. Расчет активности ведут по формуле 1!0 где А — активность фермента, выраженная в относительных ад иницах на 1 г сыров массы за ! с; Й вЂ” зарегистрированная в оп ыте оптическая плотность; ! — время, с; г) — толщина слоя <идкости (толщина к|оветы), см; а, Р, у — факторы разведения: отношение количества жидкости, взятой для приготовления в ытяжки, мл, к массе навески, г; () — степень дополнительного ра изведения вытяжки после центрифугирования (если это требовалось); Т вЂ” степень постоЯнного Разведениа вытЯжки в кювете (в наших условиях равна 4). Оформление работы.
См. равд. 1, задача 1. Результаты запишите в таблицу. Сделайте выводы о влиянии исследуемых факторов на активность ПФО. РАБОТА 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЛИПОКСИГЕНАЗ В РАСТИТЕЛЬНЫХ ТКАНЯХ Липоксигеназы (липоленат: кислород оксидоредуктаза; КФ 1.13.11.12) — класс ферментов, которые катализируют пероксидацню полипенасыщенных жирных кислот в лнпидах, содержащих цисциспентадиеновые мостики. Эти ферменты широко распространены в природе и найдены как в высших растениях, так и в грибах, водорослях и бактериях.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
